杨俊换，郭华，欧阳晶

(湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128)

据国家粮油信息中心统计，1990年中国油茶籽产量为52.3 万t，2012年为109.2 万t，累积增长了108.8%，平均年增长5.4%[1]。油茶籽壳的主要成分为木质素、纤维素与半纤维素。目前国内对油茶籽壳的利用仍处于研究阶段，主要用来制备活性炭、木糖醇和糠醛等产品，利用率较低。利用康宁木霉发酵油茶籽壳产纤维素酶，不仅可以缓解资源浪费与环境破坏问题，还可以增加油茶籽壳利用的附加值，生产的纤维素酶可以用于食品、农业和饲料等行业。利用响应面法[2–4]优化黑曲霉发酵玉米秸秆粉，滤纸酶活力最高达59.432 U/g[5]。利用响应面法优化黑曲霉产纤维素酶的发酵条件后，纤维素酶的酶活力提高了34.4% 。笔者研究利用康宁木霉发酵油茶籽壳产纤维素的优化条件，旨在为油茶籽壳的利用与纤维素酶的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

康宁木霉由湖南农业大学食品科学与技术学院微生物实验室提供。油茶籽壳由湖南农业大学康奕达油茶产品研究中心提供。

PDA 培养基的配制：将马铃薯汁200 g、葡萄糖20 g、琼脂25 g、水1 L 充分混合，121 ℃灭菌20 min。

初始产酶培养基的配制：将油茶籽壳2.5 g、麸皮0.5 g、发酵营养液20 mL 置于100 mL 锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。其中，发酵营养液为(NH4)2SO42.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、FeSO40.05 g、MnSO40.016 g、ZnSO40.014 g、CoCl20.02 g、水1 L的混合溶液。

1.2 方 法

1.2.1 油茶籽壳预处理

油茶籽壳原料(简称UTM)：油茶籽壳经自然风干后粉碎，过孔径0.45 cm 筛。

酸处理油茶籽壳(简称ACM)：将UTM 用0.5%硫酸溶液浸泡1 d，用清水洗涤至中性，于70 ℃烘干，备用。

醇处理油茶籽壳(ALM)：将UTM 用65%的乙醇溶液浸泡2 h，用清水洗涤3 次，于70 ℃烘干备用。

碱处理油茶籽壳(ETM)：将UTM 用2%的氢氧化钾溶液浸泡1 d，用清水洗涤至中性，于70 ℃烘干，备用。

1.2.2 康宁木霉产酶培养

将康宁木霉接种到PDA 斜面培养基上，28 ℃培养5 d 后，用10 mL 无菌生理盐水在无菌条件下洗出其孢子。将孢子移入试管，混匀，经血球计数板镜检，待孢子浓度为107个/mL 时按5% 接种量接入产酶培养基中，于150 r/min、28 ℃条件下摇床培养5 d。

1.2.3 粗酶液制备

初始产酶培养基接种发酵5 d 后，于50 ℃水浴恒温振荡器中振摇1 h。取适量的发酵液于4 000 r/min离心15 min。离心后的上清液即为粗酶液。将粗酶液用pH 4.8 的枸橼酸–枸橼酸钠缓冲溶液稀释到一定的倍数后，吸取0.50 mL 测定酶活力。

1.2.4 羧甲基纤维素酶酶活力的测定

1) 用3,5–二硝基水杨酸法绘制葡萄糖标准曲线。

2) 羧甲基纤维素酶(Carboxymethyl cellulase enzyme,CMCase)的酶活力测定：于干净试管中分别加入1%的CMCase (0.1 mol/L 枸橼酸–枸橼酸钠，缓冲液，pH 4.8) 1.5 mL 和0.50 mL 酶液，50 ℃准确保温30 min，沸水浴灭活，取出加入3.0 mL DNS 试剂，煮沸7 min，冷却后加蒸馏水10 mL，摇匀静置10 min，于波长540 nm 处测定光密度，并从标准曲线上查出相应的葡萄糖含量，折算成酶活力[7]。以灭活的酶液作为对照。在上述条件下， 1 min 内由水解底物生成1 μg 葡萄糖所需的酶量为1 个酶活力单位(U)[8]。每组数据均平行测定3 次。

1.3 单因素试验

以发酵培养基为基础，以发酵液中CMCase 的酶活力为指标，针对培养基中的油茶籽壳预处理方法(UTM、ACM、ALM、ETM)、氮源(0.2%的(NH4)2SO4、0.2%的(NH4)3PO4、尿素、蛋白胨、酵母膏)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)、发酵时间(1、2、3、4、5、6、7、8 d)、接种量(5%、10%、15%、20%、25%)、营养液体积(12、18、24、30、36 mL)进行单因素试验。

1.4 响应面优化试验设计

通过单因素试验，确定响应面法试验设计的因素和水平，选取3 个主要影响因子为自变量，即针对发酵时间(A)、初始pH(B)、营养液体积(C)3 个因素，根据Box–Behnken 中心组合设计原理，以发酵液中粗酶液CMCase 的酶活力为响应值，设计3因素3水平17 个试验点的响应面试验，其中零点试验重复5 次，以估计误差。中心组合试验方案中的因素及水平如表1 所示。

表1 中心组合试验设计方案中的因素及水平Table 1 Factors and levels used in the Box-Behnken design

1.5 验证试验

根据前面试验所得到的最佳发酵产酶条件进行试验，将优化试验所得到的CMCase 酶活力与发酵条件进行拟合，以验证模型的可靠性。

1.6 数据分析

利用统计软件Design–Expert 7.1.6 进行回归分析，建立CMCase 活力关于发酵条件的回归模型。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

以葡萄糖含量为横坐标(x)，以OD为纵坐标(y)，绘制葡萄糖标准曲线，其方程y =0.431 3x–0.004 6，R2= 0.999 6。曲线可信度较高，可以应用。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 油茶籽壳预处理方式的选取

由表2 可见，各预处理方式对CMCase 酶活力的影响较大，碱处理、醇处理、酸处理油茶籽壳的CMCase 酶活力依次减小，未处理油茶籽壳的CMCase 酶活力最低。考虑到碱处理油茶籽壳的成本比较低，而其发酵产CMCase 的酶活力较高，故选择碱处理作为油茶籽壳的预处理方式。

表2 康宁木霉产CMCase 的酶活力单因素试验结果Table 2 Results of the single factor experiment for CMCase activity using Trichoderma koningii

2.2.2 适宜氮源的选取

由表2 可见，康宁木霉可以利用多种氮源，氮源种类对CMCase 酶活力有较大影响，硫酸铵、磷酸铵等无机氮源比有机氮源发酵油茶籽壳产CMCase的酶活力高。虽然氮源并不能作为诱导纤维素酶的诱导物，但对菌体的迅速增长有很重要的作用，对产酶影响较大。利用无机氮源发酵油茶籽壳的成本较低，酶活力较高，故选择硫酸铵作为发酵氮源。

2.2.3 适宜初始pH 的选取

由表2 可见，发酵培养基初始pH 为4.0～6.0，随pH 升高，发酵CMCase 的酶活力明显增加，pH为6.0 时达到最高，随后随pH 升高，酶活力呈下降趋势。产CMCase 发酵培养基适宜的起始pH 为6.0，自然pH。

2.2.4 适宜发酵时间的选取

由表2 可见，发酵时间对CMCase 的酶活力影响较大，发酵时间为1～5 d 时，随发酵时间的延长CMCase 的酶活力明显增加，在发酵5 d 时达到最高，CMCase 的酶活力为142.87 U/mL；随后随发酵时间的增加，CMCase 的酶活力下降，故认为5 d为适宜发酵时间。

2.2.5 适宜接种量的选取

由表2 可见，随着接种量的增加，CMCase 的酶活力呈降低趋势。发酵培养基中含氧量与营养物质是一定的，接种量越多，则孢子生长竞争越大，导致CMCase 的酶活力降低；接种量越小，则导致进入对数期的时间延长，发酵周期长，故认为适宜接种量为5%。

2.2.6 适宜装样量的选取

由表2 可见，随着营养液体积的增加，CMCase的酶活力先增加后减小。营养液体积为12～24 mL时，营养物质的增加促进康宁木霉的生长，酶活力增加，在营养液体积为24 mL 时，CMCase 的酶活力达143.70 U/mL；营养液体积进一步增加，接触氧气的液面减少，发酵受到抑制，CMCase 的酶活力降低，故认为适宜营养液体积为24 mL。

2.3 发酵条件优化结果

2.3.1 回归模型的建立及分析结果

对表3 中数据进行回归分析，得方程y = 11.1 x1– 5.505 x2–22.477 5 x3–18.222 5 x1x2+21.677 5 x1x3+ 16.907 5 x2x3–36.834 3 x12–29.524 3x22–30.949 3x32。式中：y 为CMCase 的酶活力(U/mL)，x1为发酵时间，x2为初始pH，x3为营养液体积。对上述回归方程进行检验，模型的校正决定系数为0.997 8，说明此模型能解释99.78%响应值的变化，即此模型与数据拟合度很高，试验误差小。对方程系数进行方差分析，模型的一次项、二次项交互影响显著，各影响因素对CMCase 酶活力的影响不是简单的线性关系，其影响从大到小依次为营养液体积、发酵时间、初始pH。对该模型进行方差分析和对模型系数进行显著性检验的结果表明，回归模型极显著(P＜0.01)，说明建立的模型有意义；模型失拟项之间的差异无统计学意义(P=0.056 9＞0.05)，说明模型拟合度良好，可用此模型和方程来分析和预测发酵油茶籽壳产CMCase 的酶活力大小。

表3 中心组合试验设计方案及CMCase 酶活力响应值Table 3 Scheme of Box-Behnken design and response values of CMCase activity

2.3.2 响应面分析结果

由响应面分析结果(图1～3)可见，在营养液体积一定时，随着发酵时间与初始pH 增加，发酵液中CMCase 的酶活力先增加后减小；在初始pH 一定时，随着发酵时间与营养液体积增加，发酵液中CMCase 的酶活力先增加后减小；在发酵时间一定时，随着pH 与营养液体积的增加，发酵液中CMCase的酶活力先增加后减小。利用Design–Expert 7.1.6进行优化处理，得到使得CMCase 酶活力最大的发酵条件为培养时间5.09 d、初始pH 5.77、营养液体积21.63 mL。CMCase 酶活力最大预测值为179.324 U/mL。

图1 培养时间(A)与初始pH(B)对CMCase 酶活力影响的响应面分析结果Fig.1 Chart of response surface on the effects of days of fermentation and initial pH values on CMCase activity

图2 培养时间(A)与营养液体积(C)对CMCase 酶活力影响的响应面分析结果Fig.2 Chart of response surface on the effects of days of fermentation and volume of liquid on CMCase activity

图3 初始pH(B)与营养液体积(C)对CMCase 酶活力影响的响应面分析结果Fig.3 Chart of response surface on the effects of initial pH value and volume of liquid on CMCase activity

2.3.3 验证试验

根据单因素试验与响应面试验得到的结果，考虑到试验的可操作性，在如下条件下进行用油茶籽壳发酵产纤维素酶的验证试验：原料预处理采用碱处理法，氮源采用0.2%的(NH4)2SO4，接种量为5%，初始pH 为5.8，营养液体积为22 mL，发酵时间为5 d。5 组验证试验发酵液的平均CMCase 酶活力为179.15 U/mL，预测值与试验值之间具有良好的拟合性，表明模型有效、可靠。

3 结论与讨论

根据本研究结果，经综合考虑，认为油茶籽壳发酵产纤维素酶的适宜条件为：油茶籽壳预处理采用碱处理方法，以0.2%的(NH4)2SO4为氮源，种子液接种量为5%，初始pH 为5.8，营养液体积为22 mL，发酵时间为5 d。优化条件下CMCase 的酶活力为179.15 U/mL，比单因素试验最高酶活力提高了24.52%。

国内外学者多以里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)和青霉(Penicillium sp.)作为菌株，以酒糟、稻草、玉米秸秆等为碳源生产纤维素酶[9–11]，如王菁莎[10]等利用康宁木霉固态发酵稻草粉，滤纸酶活力为172.3 U/mL；武香玉[11]等采用固态发酵酒糟的方法生产纤维素酶，其CMCase 的酶活力为7 105.92 U/g。本研究中采用纤维素酶高产菌种康宁木霉发酵油茶籽壳，产出的纤维素酶的酶活力虽然比利用稻草、酒糟等的低，但其可为油茶籽壳的综合利用提供参考。目前，中国的纤维素酶工业仍处于研究、开发阶段，全国仅有少数几家工厂在小批量试产，产品供不应求，因此，利用油茶籽壳液体发酵生产纤维素酶具有广阔的开发前景。

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