胡丽丽，赵小鸽，倪 磊，王爱英，杨 娟,

(西安交通大学医学院：1. 遗传学与分子生物学系；2.环境与疾病相关基因教育部重点实验室、生物医学基础研究中心， 陕西西安 710061)

各种动物模型建立后，研究人员通常期望能够从DNA、RNA以及蛋白质水平对某一特定的组织或部位进行深入的研究。 但是，所研究的动物具有个体差异性，采用不同的动物分别进行DNA、RNA以及蛋白质3个水平的研究极有可能出现实验结果的不一致性；其次，所研究的特定部位通常具有不可分割性，或者动物的组织材料量较少，不足以分别进行DNA、RNA以及蛋白质3种物质的提取。因此，如果同时从某一特定的组织或部位提取DNA、RNA以及蛋白质这3种物质进行后续检验分析，将提高实验结果的一致性和准确性。

海马区又名海马回、海马体或大脑海马，是位于脑颞叶内的一个部位的名称。人有两个海马，分别位于左右脑半球。海马属于大脑边缘系统的组成部分，与学习记忆密切相关[1-2]；其参与调节衰老引起的自主神经系统、免疫系统和神经内分泌系统的活动[3]；也是大脑中与抑郁症密切相关的结构之一[4]。此外，在各种应激模型中，海马与HPA轴及糖皮质激素密切关联[5-6]。

本研究以单侧海马组织为材料采用Trizol法，分别从上层水相、中间相和有机相中制备总RNA、基因组DNA 和总蛋白质。通过聚合酶链式反应(PCR)对Trizol法提取海马基因组DNA的效果和试剂盒提取效果进行比较，采用蛋白免疫印迹(Western blot)法将Trizol法对海马蛋白的提取效果和传统的蛋白裂解液裂解法进行比较，分析Trizol法的优势。

1材料与方法

1.1实验动物成年雄性Sprague-Dawley大鼠8只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2主要试剂及仪器Trizol试剂(Invitrogen公司)；RIPA裂解液；逆转录试剂盒Primescript RT reagent kit(TaKaRa公司)；SYBR Premix EXTaqⅡ(TaKaRa公司)；DNA提取试剂盒(BioTeke 公司)；PremixTaqTM(TaKaRa公司)；抗β-actin抗体(博奥森)；GR抗体(Santa Cruz Biotechnology)。凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)；PCR热循环仪(Biometra Thermocycler)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)。引物由上海生工公司合成，β-actin引物[7]：上游：5′-CTATCGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游：5′-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3′，PCR产物长242 bp；Nr3c1引物：上游：5′-AGGCAGTGTGAAATTGTATCCCAC-3′，下游：5′-GAGGCTTACAATCCTCATTCGTGT-3′，PCR产物长206 bp。

1.3大鼠海马组织的取材与保存用40 mL/L水合氯醛麻醉SD大鼠，在低温环境下快速断头取脑，冰上分离海马组织。将左右两侧海马均放入冻存管中，液氮速冻后放入-80 ℃低温冰箱备用。

1.4Trizol法同时提取大鼠海马组织RNA、DNA和蛋白质

1.4.1提取大鼠海马组织RNA 将左侧海马从-80 ℃低温冰箱中取出，移入无菌无酶1.5 mL EP管中，加入100 μL Trizol，使用电动研磨器研磨海马组织15～30 s，加入900 μL Trizol。按照Trizol说明书操作步骤，室温放置5 min，冰上放置10 min(期间不时颠倒混匀)，加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，4 ℃ 12 000×g 离心10 min，小心取上层水相于一新的无菌无酶1.5 mL EP管中，中间层白膜和下层粉红色有机相保留。在上层水相中加0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置15 min，4 ℃ 12 000×g 离心10 min，小心弃去上清，加入1 mL 750 mL/L无水乙醇，涡旋混匀，4 ℃ 7 500×g离心5 min。用1 mL 750 mL/L无水乙醇再次洗涤沉淀。小心弃去上清，然后室温干燥5 min，用40 μL DEPC水溶解RNA沉淀，用枪头反复吹打助溶。保存于-80 ℃低温冰箱中。

1.4.2提取大鼠海马组织DNA 按照Trizol说明书操作步骤，尽量移去RNA提取步骤中上层残留水相，加入0.3 mL无水乙醇，颠倒混匀，室温放置3 min，4 ℃、2 000×g离心5 min。移上清至一新EP管中(上清用做分离蛋白质，操作见后)，加入1 mL 0.1 mol/L 柠檬酸钠洗涤DNA沉淀，室温放置30 min，其间轻轻颠倒混匀。4 ℃、2 000×g 离心5 min，弃上清，重复1次。室温放置5～10 min，用60 μL 8 mmol/L NaOH溶解DNA。保存于-20 ℃冰箱中。

1.4.3提取大鼠海马组织蛋白质 按照Trizol说明书关于蛋白质提取的操作步骤，加入1.5 mL异丙醇至DNA提取步骤中用做分离蛋白质的上清中，混匀，室温放置10 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清。加2 mL 0.3 mol/L盐酸胍洗涤液，室温放置20 min，4 ℃、7 500×g离心5 min，弃上清，重复2次。加入2 mL无水乙醇使用同样方法再洗1次。室温干燥蛋白质沉淀10 min，加入80 μL 10 g/L SDS反复吹打溶解蛋白质。保存于-80 ℃低温冰箱中。

1.5试剂盒提取大鼠海马组织DNA采用细胞/组织DNA提取试剂盒(离心柱型)，购自北京BioTeke公司，实验步骤参照试剂盒说明书。

1.6RIPA裂解液提取大鼠海马组织蛋白质将右侧海马从-80 ℃低温冰箱中取出，放入无菌研磨器内。在裂解液中加入适量PMSF(使用前数分钟加入)，使PMSF的最终浓度为1 mmol/L。吸取混合液700 μL加入研磨器中，冰上充分研磨组织并静置1 h，4 ℃、14 000×g 离心15 min，取上清置于1.5 mL EP管中。保存于-80 ℃低温冰箱中。

1.7RNA质量的检测

1.7.1RNA的浓度、纯度鉴定 利用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定RNA在260 nm和280 nm处的吸光值，根据260 nm与280 nm吸光值的比值鉴定RNA纯度。

1.7.2SYBR实时定量RT-PCR法检测大鼠海马中β-actin和GR的表达 按照逆转录试剂盒使用说明配置反应体系，反转录反应条件为37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，获得的cDNA置于4 ℃。按照SYBR Premix EXTaqⅡ试剂盒使用说明配置反应体系，应用两步法进行PCR扩增。扩增条件为：预变性，95 ℃ 30 s；扩增反应，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环；溶解曲线分析，95 ℃ 0 s， 65 ℃ 15 s， 95 ℃ 0 s。每个样品的每个基因设3个重复。

1.8DNA质量的检测

1.8.1DNA的浓度、纯度鉴定 同RNA浓度、纯度的鉴定。此外，同时对总DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

1.8.2以Trizol法和试剂盒法提取的大鼠海马DNA为模板的PCR扩增 按照PremixTaqTM说明配置PCR反应体系，模板Trizol法和DNA提取试剂盒提取大鼠海马DNA，引物为β-actin和Nr3c1的上下游引物。扩增条件为：预变性，98 ℃ 5 min；扩增反应，98 ℃ 10 s， 55 ℃ 30 s；后延伸，72 ℃ 50 s；72 ℃ 5 min。

1.9Westernblot法比较Trizol法和RIPA试剂盒提取的大鼠海马蛋白质量蛋白定量后，各取30 μg上样，用SDS-PAGE凝胶进行电泳，具体条件为：80 V电压下电泳30 min，100 V电压下电泳1 h，用PVDF膜半干转膜2 h，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加GR抗体或做内参的β-actin抗体(一抗)，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，加HRP标记的羊抗兔IgG(二抗)，室温下孵育2 h，PBST洗膜3次，加化学发光底物在化学发光系统中显示杂交印迹。

2结果

2.1RNA质量的检测结果

2.1.1RNA的质量浓度和纯度 经超微量分光光度计对RNA的浓度和纯度进行测定，8个样品的浓度、A260/A280和A260/A230的比值见表1。Trizol法提取单侧海马RNA的质量浓度介于1 178.3 ～2 225.8 ng/μL之间，A260/A280介于2.01～2.03，A260/A230介于1.88～2.22。以上结果表明，Trizol法提取单侧海马RNA的浓度和纯度较高且较为稳定。

表1 Trizol法提取单侧海马组织RNA的质量浓度和纯度

2.1.2SYBR实时定量 RT-PCR检测海马组织中β-actin和GR mRNA的表达情况 通过荧光实时定量RT-PCR检测，获得了β-actin和GR的循环域值(CT值)(表2)。扩增曲线和溶解曲线提示扩增产物高效且为特异性扩增。

表2 β-actin和GR的循环域值

2.2DNA质量的检测结果

2.2.1DNA的质量浓度和纯度 经超微量分光光度计对Trizol法和试剂盒提取DNA的质量浓度和纯度进行的测定，8个样品的浓度(编号1～4为Trizol法，编号5～8为试剂盒法)、A260/280和A260/230的比值见表3。

表3 两种方法提取单侧海马组织DNA质量浓度和纯度

1～4：Trizol法；4～8：试剂盒法。

Trizol法提取单侧海马的DNA的质量浓度介于215.7 ～271.8 ng/μL之间，A260/A280介于2.03～2.07，A260/A230介于2.33～2.49。试剂盒提取DNA的浓度和纯度处于268.6 ～872.5 ng/μL之间，A260/A280介于1.54～1.86，A260/A230介于1.21～2.04。对两种方法提取的总DNA各取10 μL进行琼脂糖凝胶电泳，比较结果发现，Trizol法提取的总DNA完整性均较好(图1)。对Trizol法和试剂盒提取DNA的浓度、A260/A280和A260/A230进行统计学分析(SPSS 16.0)，结果表明两种方法的浓度不具有统计学差异(P>0.05)，A260/A280和A260/A230具有统计学差异(P<0.01)。以上结果表明，Trizol法提取单侧海马DNA的浓度和纯度较高且较为稳定。

图1 Trizol和试剂盒法提取的总DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2.2Trizol法和试剂盒法所提取的大鼠海马组织DNA的PCR扩增结果 以上两种方法提取的基因组DNA为模板，经特定引物进行PCR扩增后发现，管家基因β-actin(242 bp)和糖皮质激素受体基因Nr3c1(206 bp)均有清晰的条带，未见非特异性扩增(图2、图3)。所以两种方法提取的基因组DNA均适于作为基因扩增的模板。

2.3Trizol法及RIPA试剂盒法提取的大鼠海马蛋白的Westernblot结果Trizol法和RIPA试剂盒提取大鼠海马蛋白在针对特异蛋白的抗体作用下，Western blot结果显示单一清晰的条带(图4)。由此可见，Trizol法和RIPA试剂盒提取大鼠海马蛋白质量差异不大，均适于采用Western blot法对目的蛋白进行检测。

3讨论

Trizol法适用于从细胞和组织中快速分离RNA。Trizol法有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA、DNA及蛋白质。Trizol法不仅可用于小量样品(50～100 mg 组织、5×106个细胞)，也适用于大量样品(≥1 g组织、>107个细胞)。对人、动物、植物组织及细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在1 h内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于 Northern Blot、dot blot、ployA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果2条引物存在于1个单一外显子内，建议用无RNase的 DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western blotting实验[8-9]。

图2 两种方法提取的模板DNA的β-actin PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图

图3 两种方法提取的模板DNA的Nr3c1 PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图

图4 Trizol法(1～4)和RIPA试剂盒(5～8)提取蛋白的Western blot结果

海马是涉及学习记忆能力实验的主要研究对象，且在应激动物模型中具有重要作用。近年来，对模型动物海马区的研究已经从形态学深入到分子、细胞、蛋白水平。因此，越来越多的研究需要从动物海马组织DNA、RNA以及蛋白质3方面来开展实验研究。而迄今为止，使用Trizol法从海马组织同时提取这3种物质的研究未见报道。本研究结果表明，Trizol法同时提取的大鼠单侧海马组织RNA 、DNA和蛋白质，与使用已市场化试剂盒从不同海马组织中分别提取的DNA和蛋白质在质量上无明显差异，并且均适合进行后续的PCR及Western blot实验。从同一单侧海马组织中同时提取得到的较高质量RNA 、DNA和蛋白质，使得RNA 、DNA和蛋白质3个水平的研究可以很好的保持同一性，减少了实验过程中不必要的干扰因素，优化了实验方案；同时减少了实验人员的劳动量，提高了工作效率，使实验动物的使用量减少至最低。目前，同时提取海马组织RNA 、DNA和蛋白质的文献较少，故Trizol法同时提取这3种物质为科研人员对海马组织的研究提供了更为合理和便利的条件。

参考文献：

[1] MILLER CA, SWEATT JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation[J]. Neuron, 2007, 53(6):857-869.

[2] BOWMAN RE, BECK KD, LUINE VN. Chronic stress effects on memory: sex differences in performance and monoaminergic activity[J]. Horm Behav, 2003, 43(1):48-59.

[3] MCEWEN BS. Sex, stress and the hippocampus: allostasis, allostatic load and the aging process[J]. Neurobiol Aging, 2002, 23(9):921-939.

[4] QI X, LIN W, WANG D, et al. A role for the extracellular signal-regulated kinase signal pathway in depressive-like behavior[J]. Behav Brain Res, 2009, 199(5):203-209.

[5] ANDRUS BM, BLIZINSKY K, VEDELL PT, et al. Gene expression patterns in the hippocampus and amygdala of endogenous depression and chronic stress models[J]. Mol Psychiatr, 2012, 17(1):49-61.

[6] ROOZENDAAL B, GRIFFITH QK, BURANDAY J, et al. The hippocampus mediates glucocorticoid-induced impairment of spatial memory retrieval: dependence on the basolateral amygdala[J]. P Natl Acad Sci USA, 2003, 100(2): 1328-1333.

[7] XIAO L, CHEN Y. Culture condition and embryonic stage dependent silence of glucocorticoid receptor expression in hippocampal neurons[J]. J Steroid Biochem, 2008, 111(6):147-155.

[8] 汪军，金凯舟，王娟，等. 一种高效同时提取微量组织中总RNA、DNA和蛋白的技术方法的改进[J]. 肝胆胰外科杂志, 2012, 24(4):308-313.

[9] 董华，王军军，应天翼，等. 一种同时提取细胞总RNA和总蛋白的方法[J]. 生物技术通讯, 2005,16(6):649-650.