王丽娜，王丽艳，刘景文，郭永霞*，金 勋，芮海英

(1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319;2.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319;3.大庆市农业委员会，黑龙江 大庆 163319)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为豆科苜蓿属多年生草本植物，是具有丰富的营养价值和强大生态功能的优质牧草，被全世界广泛种植。然而，近年来随着全球生态环境的日益恶化，出现的低温﹑盐渍﹑干旱等非生物胁迫环境，严重威胁紫花苜蓿的生长，限制了牧草产业化发展。黑龙江省盐碱地总面积约占188万公顷［1］，尤其西部地区的肇源﹑安达、大庆是重要的畜牧生产基地，也是盐碱化较重，面积较大的区域，pH都达到了8.0以上［2］。为了保证该地域畜牧业的持续发展，还需要充分的利用和改良盐碱地来提高牧草的生产率。现代分子生物学与基因工程技术的结合，通过向牧草中导入抗逆相关目的基因，获得抗逆性更强的牧草新品种，对提高牧草抗逆性和产量有重要意义。

近年来，与植物抗逆性相关的基因核苷二磷酸激酶(NDPKs)在转基因工程中备受关注，其是一种由数个16-20 kD多肽组成的70-100 kD的蛋白质，广泛存在于原核和真核生物中［3］，它不仅作为一种“看家酶”来维持细胞NDP和NTP的代谢平衡，而且还是一组多功能蛋白酶，参与细胞的生长和分化并与信号转导有关，参与热胁迫响应以及H2O2介导的氧化胁迫响应等等［4-6］。植物中 NDPKs大体上分为NDPK1，NDPK2，NDPK3三种类型，其中 NDPK2与多种胁迫响应相关。研究发现转NDPK2基因的拟南芥能够耐受－7℃低温胁迫1 h，离体叶片耐受1 μmol·L-1甲基紫精(MV)7 d［7］;转 AtNDPK2 基因的马铃薯能够耐受80 mmol·L-1NaCl胁迫及42℃高温胁迫［8］。这些研究结果充分说明NDPK2的过量表达能够通过调解氧化还原系统来提高转基因植株对低温、高盐和氧化等非生物胁迫的抗性。

本研究的主要目的是将甘薯过氧化物酶启动子(SWPA2)驱动下的AtNDPK2基因通过农杆菌介导法转入紫花苜蓿受体系统中，建立转化体系;利用PCR技术初步检测出阳性植株，并对获得的阳性转基因植株进行盐胁迫分析，确定该基因的转化是否增强了苜蓿植株的耐盐性，为后期苜蓿新种质遗传选育奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿品种“敖汉”由黑龙江省畜牧研究所提供;含有目的基因AtNDPK2的植物表达载体pCAMBIA2300由韩国生命工学研究院郭尚珠教授惠赠(图1-1A，1B)，可用于遗传转化的根癌农杆菌(Agrobacferium tumefaciens)菌株EHA105由黑龙江八一农垦大学分子实验室建立并保存。

图1 -1A pCAMBIA2300质粒载体图谱Fig.1 -1A Plasmid vector map of pCAMBIA2300

1.2 农杆菌介导的转化及再生植株的获得

农杆菌EHA105经活化后，当菌液的OD600为0.6～0.8时，侵染经预培养3～5 d的下胚轴10～15 min后，转接到含有50 mg·L-1乙酰丁香酮(AS)和2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT 的改良 SH 培养基上共培养2～3 d，经Cef脱菌后先转接到仅含350 mg·L-1Cef和 2 mg·L-12，4-D+0.15 mg·L-1KT的改良SH培养基上进行一段时间培养后，再转接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan以及0.1 mg·L-1KT改良的 SH培养基上诱导抗性分化芽，待抗性分化芽长至2～3 cm时随后将其转接到含有350 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Kan的1/2MS培养基培养生根苗，培养14 d左右长至2～3条根后驯化移栽。

1.3 抗性植株的分子生物学鉴定

图1 -1B 含有AtNDPK2基因的质粒载体Fig.1 -1B The vector structure with AtNDPK2 gene

利用CTAB法提取苜蓿植株叶片的基因组DNA，以AtNDPK2基因为模板设计一对特异性引物，上游:5'-CACCATGGTGGGAGCGACT-3'，下 游:5'-TCTGTCTAGACAAGGATCA-3'，进行PCR扩增。PCR反应体系(25 μL):DNA模板1 μL，上游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 mmol·L-1)0.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)2 μL，10 ×loading buffer 2.5 μL，Taq 酶 2.5 μL。PCR 反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸8 min，4℃终止保存。电泳及凝胶成像观察扩增出来的目的条带的分子量大小是否在540 bp左右。

1.4 转基因苜蓿的耐盐性分析

选取生长状态良好的转基因和非转基因苜蓿经组织培养后，将获得的组培苗转接到含有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0%NaCl的 1/2MS 的培养基中进行盐胁迫处理，每处理重复3次(瓶)，每重复(瓶)4株，培养温度25±2℃，光照强度2000～3000 lx，光周期时间16 h/8 h。经3周盐胁迫后各处理分别取样。

1.5 各生理生化指标的测定

利用氮蓝四唑法［9］和愈创木酚法［10］测定超氧化物酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性，利用电导仪法［9］测定质膜透性及硫代巴比妥酸(TBA)比色法［11］测定丙二醛含量，每处理重复测定3次，取3次平均值。

2 结果与分析

2.1 转基因苜蓿的获得

通过农杆菌EHA105(pCAMBIA2300)介导的转化获得转基因“敖汉”苜蓿23株，转化率为23.3%。

2.2 抗性植株的PCR检测

因AtNDPK2基因片段的扩增条件已经很明确，所以设计特异性引物进行PCR扩增，以质粒DNA为阳性对照，以非转基因植株为阴性对照。对获得的23株抗性植株进行PCR检测。结果有20个株系扩增出了约530 bp左右的目的片段，转化率为86.9%(图2-1部分结果图片)。初步表明AtNDPK2基因已经整合到“敖汉”苜蓿的基因组中。

2.3 盐胁迫下苜蓿植株的生长状况

将转基因植株和非转基因植株的组培苗进行扩繁后，选择大小形态一致的再生苗进行不同浓度的盐胁迫处理，非转基因组培苗作为对照。发现NaCl浓度为0% ～0.4%处理中，两者之间组培苗的大小形态没有明显的变化。随着处理浓度增大，NaCl浓度为0.6%处理中，发现转基因植株的叶片水浸状、萎蔫数量明显的少于对照，并顶部叶片处于平展状态，而对照组叶片呈现水浸状，萎蔫数量多，顶部叶片卷曲(图2-2)。随着盐浓度加大和处理时间的延长对照组植株在NaCl浓度≧0.6%逐渐黄化死亡，转基因组培苗叶片呈现水浸、萎蔫、卷曲的数量随浓度升高而增多，在NaCl浓度达到1.0%处理中没有死亡现象发生。由此说明了AtNDPK2基因的转化增强了苜蓿应对高盐浓度的耐受性，叶片受胁迫响应出现症状明显。

2.4 盐胁迫下相对电导率和丙二醛(MDA)含量变化

转基因植株和非转基因植株在0%～0.2%NaCl处理浓度下，细胞内电解质相对渗出率较低，两者之间相对电导率没有明显的差异。随着盐浓度的升高非转基因植株质膜相对电导率显著增大，而转基因植株相比于0% ～0.2%NaCl处理增大的幅度不明显，表现出转基因植株的相对电导率相比较非转基因植株显著降低最后趋于平稳。在非转基因植株中丙二醛含量的变化趋势为随着盐处理浓度的升高，丙二醛含量是逐渐升高的，而转基因植株的丙二醛含量在0.2%NaCl处理下与非转基因植株没有显著的差异，当盐浓度＞0.2%时，转基因植株相比较非转基因植株丙二醛含量明显降低，与非转基因植株呈显著性的差异，随着盐处理浓度的增大转基因植株的丙二醛含量趋于平稳(图2-3)。电解质相对电导率和丙二醛含量是衡量植物质膜完整性和膜质过氧化程度的标准，该结果表明高盐胁迫下，转基因植株细胞膜受伤害小，细胞膜完整性较好，膜质的过氧化程度低，植株遭受损害轻，NDPK2基因的过量表达提高了植株的耐盐性。

2.5 盐胁迫下超氧化物酶(SOD)活性变化

转基因植株和非转基因植株在0%～0.2%盐胁盐胁迫下维持正常生理活动，提高植株耐盐能力。

图2-1 转AtNDPK2植株的基因组DNA提取及PCR扩增的目的基因Fig.2-1 Genomic DNA extracted of AtNDPK2 and the target gene of PCR amplifing

图2-2 盐胁迫下非转基因植株(A)，转基因植株(B)的表现形态Fig.2-2 The performance of non-transgenic plant(A)，transgenic plant(B)under salt stress

2.6 盐胁迫下过氧化物酶(POD)活性变化

图2-3 盐胁迫下植株相对电导率(%)和丙二醛含量(%)的变化Fig.2-3 The changes relative elecrtrical conductivity(%)and MDA(%)of plant under salt stress

非转基因与转基因植株在不同的盐浓度下POD的活性变化各不相同，当NaCl浓度达到0.4%时非转基因植株的POD活性达到最大值，随着盐浓度的不断增加，非转基因植株POD活性不断下降;而转基因植株的POD活性一直维持在较高水平。POD也是一种植物细胞内的保护性酶，不仅与植物抵御不良环境条件有关，而且它还与植物抵御各种病害和环境中某些营养元素胁迫以及植物抗衰老有关。大部分试验证明，POD活性越高，植株的抗逆性越强。该迫条件下超氧化物酶(SOD)的活性都没有发生明显的变化，当盐处理浓度≥0.4%的时，两者的SOD酶活性显著增高。随盐浓度的增加，非转基因植株SOD活性呈现出降低的趋势，当NaCl浓度为1.0%时SOD酶活性最低;而转基因植株SOD活性则呈现出不断升高，SOD活性显著的高于非转基因植株，并随盐浓度增大而趋于平稳(图2-4)。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的保护酶，能够有效清除因胁迫或损伤造成的细胞产生大量自由基或过氧化物，使它们维持较低水平，避免细胞结构受到危害。该结果说明了SOD活性越高越有利于转基因植株在结果说明了POD酶活性越高，植株细胞损伤程度越小，从而提高了苜蓿的耐盐性。

3 讨论

近年来，对于紫花苜蓿植株的遗传转化研究比较广泛，转化的基因类型主要包括品质改良，抗病、虫害，抗除草剂，抗逆相关基因以及作为生物反应器等［12］。其中对于抗逆基因的转化研究比较深入。大多数研究结果表明植株的抗逆性往往是受多基因控制的，单一功能基因的导入，并不能达到预期的效果。本实验选用甘薯过氧化物酶启动子(SWPA2)，SWPA2是一种较强的胁迫诱导型启动子，更加适用于培育耐环境胁迫的转基因植物研究［13，14］。NDPK2又是一种促进多种抗氧化酶表达的抗逆基因［15］。两者组合达到了提高抗逆性的双重功效，这将对增强苜蓿转基因植株的耐盐性具有重要意义。

图2-4 盐胁迫下植株超氧化物酶(SOD)活性变化Fig.2-4 The changes SOD activity of plant under salt stress

图2-5 盐胁迫下植株过氧化物酶(POD)活性变化Fig.2-5 The changes POD activity of plant under salt stress

基因的转化是否增强了植株的耐盐性，需要对转基因植株进行了耐盐性验证。研究结果显示当转基因植株受到0.4% ～1.0%NaCl胁迫时，SOD、POD活性上升，非转基因植株的SOD、POD也在逐渐上升只是两者的活性表现上升幅度不同，转基因植株酶活性始终高于非转基因植株。当NaCl浓度0.6%胁迫7 d时发现非转基因植株出现了叶片呈现水浸、卷曲、萎蔫症状，而转基因植株表现不明显。SOD，POD是清除活性氧自由基的关键酶［16，17］，在氧化胁迫反应早期起主要调节作用［18］，所以该生理生化指标可用来衡量植株的耐盐性。转基因植株与非转基因植株质膜相对电导率及丙二醛含量也表现出显著性差异，随着盐浓度的增加，发现转基因植株的相对电导率及丙二醛含量明显低于非转基因植株，而非转基因植株相对电导率及丙二醛含量呈现上升趋势。相对电导率变化可反映质膜的破坏程度及植株的抗逆性强弱［19-21］，丙二醛含量变化也可反映植物遭受逆境伤害的程度［22］。该试验获得的结果充分说明在高浓度盐胁迫下，转基因株系膜脂质过氧化程度低，膜结构受到的伤害较小，质膜的选择透性强，植株受损程度小，进一步证实了AtNDPK2基因的转入提高了转基因“敖汉”苜蓿的耐盐性。农杆菌EHA105菌株介导转化SWPA2启动子驱动的AtNDPK2基因增强了“敖汉”苜蓿植株的耐盐性。

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