张亚军

(浙江省绍兴市咸亨酒店食品有限公司，浙江 绍兴 312071)

乳酸菌和霉菌在欧美被广泛用作肉制品的发酵剂，用于生产青纹干酪、烟熏香肠、干香肠等。目前我国只有金华火腿属于霉菌发酵肉制品。一般来说，植物乳杆菌发酵会赋予食品柔和的酸味和香气，霉菌发酵型产品则独具“霉菌香味”;植物乳杆菌厌氧，而毛霉好氧;乳杆菌可以生成丰富的脂酶，但蛋白酶活性较小，毛霉则能够形成丰富的脂肪酶和蛋白酶。这些酶可以将油脂、蛋白质分解为游离脂肪酸、氨、挥发性盐基氮、游离氨基酸等，从而使产品具有特殊的香气。本研究针对毛霉和植物乳杆菌的不同生物特性，结合不同加工工艺，综合考查其对草鱼干品质的影响。

1 材料方法

1.1 材料

植物乳杆菌来自中国工业微生物菌种保藏管理中心;腐乳毛霉从浙江绍兴等地的腐乳中分离而得;草鱼市购。

YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器 (上海博讯医疗器械);LRH-150恒温恒湿生化培养箱 (关东医疗器械厂);SW-CJ洁净工作台 (苏州安泰);PHS-3C型精密pH计 (苏州安泰);721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)等。

1.2 工艺流程

取鲜活草鱼切成约10 cm×15 cm的小块，用5%的盐水冲洗，然后于10℃下，在5%盐水中腌制12 h，之后在40℃，2～3 m·s-1，相对湿度35%左右的空气条件下干燥4 h至水分含量降至70%以下。在风干后的样品上喷涂毛霉发酵剂，恒温恒湿发酵;再将样品置于酸菌液中浸泡，密封恒温发酵，然后将样品进行真空包装，高温灭菌。

1.3 菌种活化及扩大培养

将植物乳杆菌菌种接种在固体培养基上活化两次后，转入MRS液体培养基中，36℃培养24 h。取番茄汁200mL、葡萄糖50 g、脱脂奶粉24 g、蒸馏水1 L溶解，加入K2HPO43～5 g，调节pH值为6.5，制备培养基，经115℃灭菌20min后，冷却至25℃，接种5%活化的植物乳杆菌，于36℃培养36 h，之后放入4℃冰箱中保存备用。

将毛霉菌种接入马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基(PDA)，于25℃培养48 h;转接斜面菌种到三角瓶培养基 (豆渣∶麸皮为9∶1)中，25℃培养48 h至菌丝和孢子生长旺盛。在上述三角瓶中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒还三角瓶，再加200mL无菌水洗涤1次，合并滤于第1次滤液中，制成霉菌分生孢子悬浮液，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。

1.4 处理设计

毛霉属于好氧型微生物，在鱼肉内部无法生长。鱼干脱水后期，将毛霉发酵分生孢子悬浮液均匀喷洒在鱼块表面，以悬挂状态恒温恒湿 (相对湿度80% ～90%)进行霉菌发酵。以发酵时间、霉菌接种量、发酵温度为试验因素，进行正交试验，对感官和水分指标测定综合评分，确定霉菌适宜的发酵条件，1-3水平发酵时间 (A)分别为12，24和36 h，霉菌接种量(B)分别为2，4和6mL·g-1，发酵温度 (C)分别为15，20和25℃。

将经过上述处理的草鱼干同时进行乳酸发酵和霉菌发酵，按照鱼重的1%接种乳杆菌，采用装坛密封浸泡发酵，氧气耗尽后霉菌停止繁殖。将鱼块在19℃浸泡发酵60 h，分别于接种后0，24，36，48和60 h进行感官和理化评定，考查乳酸发酵对草鱼干品质的影响。

1.5 检测项目和方法

感官评定分级，好为20～25分，较好为15～20分，一般为10～15分，差为＜10分。水分评定分级，58% ～60%为20～25分，60% ～62%为15～20分，62% ～64%为10～15分，＞64%为＜10分。组织结构评定分级，肉质硬实有弹性为20～25分，肉质密实不软为15～20分，微微软化为10～15分，软化、有粘液为＜10分。色泽评定分级，色泽洁白为20～25分，稍带淡黄为15～20分，暗红为10～15分，颜色发暗为＜10分。气味评定分级，气味清香为20～25分，香味淡薄为15～20分，无异味为10～15分，有异味为＜10分。综合评定采用评分检验法，参与评定的人数为10人，均为专业技术人员。

植物乳杆菌数:取样品25 g，剪碎后加入到装有225mL无菌水的三角瓶中 (内放若干小玻璃珠)，振摇30min，然后梯度稀释至合适浓度。无菌条件下取1mL稀释样液于改良MRS培养基上，37℃培养48 h。

多肽氮 (PeN):取10 g鱼肉加50mL 5%三氯乙酸，研磨后转移上层离心清液到分液漏斗与乙醚混匀，收集下层滤液，定容到50mL，进行常量双缩脲反应测定，用氧化性谷胱甘肽绘制标准曲线。制备液用280/260 nm紫外吸收差法排除蛋白质干扰。

氨基态氮 (AN):先将鱼肉研磨，然后在50℃水浴萃取，过滤定容到100mL，茚三酮比色测定，用甘氨酸标准液绘制标准曲线。

鱼肉蛋白质用微量凯氏定氮法测定。

脂肪含量、过氧化值、酸价及含盐量按GB/T 5009.37进行测定。

2 结果与分析

2.1 处理组合的影响

发酵时间、毛霉接种量、发酵温度对草鱼干的影响如表1所示。各因素中，霉菌接种量对草鱼干品质的影响最大，其次是发酵时间，发酵温度的影响最小。最佳组合为A2B3C2，即当霉菌接种量为6mL·g-1鱼干时，在20℃条件下发酵24 h后的草鱼干感官评分最高，此时产品表面被一层白色棉絮状菌丝包裹，但并不很密实。霉菌的生长一方面会消耗掉O2，从而抑制其他好氧腐败菌的生长，另一方面消耗鱼干表面油质，有效防止氧化酸败。但霉菌接种量若过大、时间过长，则鱼干表面霉菌菌丝容易发暗，并产生一种腐臭味。

表1 各处理组合的综合评分

2.2 混合发酵的影响

由图1可知，在发酵过程中，鱼中植物乳杆菌菌数在前48 h呈上升趋势，48 h后开始下降。对应的pH值一直呈下降趋势，前期趋势很快，36 h后开始变缓。两者之间的趋势并不完全吻合，说明发酵过程中除了乳杆菌产生的乳酸外，还有其他有机酸产生，比如游离脂肪酸。

图1 发酵过程中菌落数和pH值的变化

蛋白质是鱼干中最主要的化学成分，其变化直接影响产品品质。一般来说，蛋白质降解成多肽，多肽降解成游离氨基酸，游离氨基酸进一步反应，既可以形成风味物质，也可以导致产品腐败变质。本试验中蛋白质的具体变化如图2所示。

PeN含量 (干基)在新鲜鱼中高于发酵鱼干，在发酵过程中PeN含量先上升后下降，在最终产品中含量较低。PeN含量在发酵的初始阶段上升是由蛋白降解引起的，而后期由于蛋白肽作为风味前体物质参加了其他反应，因此其含量逐步下降，而游离氨基酸AN含量渐增。发酵鱼干中含有丰富的AN(1.23%干基含量)，是新鲜鱼的7.69倍，赋予产品独特风味 (图2)。湿基含量代表了食品正常食用状态下的含量，发酵鱼干的PeN湿基含量(6.65%)远高于新鲜鱼 (1.35%)，这些游离多肽提高了鱼干风味。发酵鱼干的pH值为4.9左右，显弱酸性，可以使谷氨酸以鲜味最大的谷氨酸-钠的状态存在。

但需要指出的是，发酵中不断增加的游离氨基酸虽然可提高产品风味，但是鱼干蛋白质降解幅度不宜过大，因为游离氨基酸进一步反应降解的途径很多，并不是所有的反应都会提高其产品风味，控制不好的过度降解反而会使产品腐败变质 (图3)。总体来看，本研究中毛霉和植物乳杆菌的组合发挥了很好的正面作用。

图2 发酵过程中鱼干蛋白质 (干基含量)变化

传统鱼干在制作过程中脂肪氧化酸败现象频发。在本试验中，分别于不同加工时段取样测定脂肪含量及其酸价 (AV)、过氧化值 (POV)，从而确定产品加工过程中脂类物质水解与氧化的情况。图3表明，鱼干样品的酸价随着发酵时间的延长而增加，而脂肪含量逐渐降低，表明发酵过程中脂肪不断水解。虽然脂类物质不断分解，但鱼干的过氧化值无明显变化规律，这使鱼干在感官上产生了特有的香味。

图3 发酵过程中鱼干脂肪变化

3 小结

正交试验结果表明，当鱼干霉菌接种量为6mL·g-1时，在20℃条件下发酵24 h后的草鱼干感官评分最高，此时鱼干表面包裹一层白色棉絮状菌丝，能有效抑制好氧腐败菌发生并防止氧化酸败。后续混合发酵中，植物乳杆菌菌落数在发酵后48 h上升到顶点。pH值在发酵前期下降很快，36 h后变缓。发酵中鱼干PeN含量先上升后下降，至发酵完成，鱼干中游离氨基酸是新鲜鱼的7.69倍。鱼干的弱酸性使谷氨酸可以鲜味最大的谷氨酸-钠的状态存在，增添产品风味。照此方法进行混合发酵的草鱼干具有浓郁的发酵香气，酸味柔和，鱼腥味低，检测表明符合国家食品卫生标准和微生物学安全性，适于食用。

［1］曲冬梅，刘小杰.植物乳杆菌及其在食品工业中的应用［J］.中国食品添加剂，2008，32(7):219-222.

［2］熊涛，黄锦卿，宋苏华，等.植物乳杆菌发酵培养基的优化及其高密度培养技术［J］.食品科学，2011，32(7):262-268.