孙协军，李秀霞，刘雪飞，励建荣，吕艳芳，李 娇，王 珍，田 鑫

(渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)通常是指蔷薇科(Rosaceace)山楂属(Crataegus L.)植物的干燥果实，分为山里红(Crataegus pinnatifida Bge var.Major N.E.Br.)和 野 山 楂 (Crataeguscuneata Sieb.＆Zucc.)［1］，其中，山里红也叫北山楂，在我国北方地区广泛栽培，是重要的药食同源植物。黄酮类化合物、原花青素、三帖酸等是山楂中主要的生物活性成分，目前，从山楂中分离得到60余种黄酮类化合物，主要包括以芹菜素和木犀草素为苷元的苷类以及以芦丁、金丝桃苷和槲皮素为主的黄酮醇及氧苷类物质［2－4］。黄酮类化合物具有降血脂［5］、降血糖［6－7］、预防肝损伤［8－9］、抗氧化［10］及提高机体免疫力［11］等生理活性，是山楂果实及叶片中主要的生物活性成分。目前提取黄酮的方法主要有浸提［12－13］、超声波辅助提取［14］、微波提取法［15］和酶法［16］等，超声波辅助提取法是一种从植物中提取有效部分的重要方法，超声空化作用能使细胞壁破裂从而有助于内容物的浸出，增加了溶剂向细胞内的扩散和有效成分的溶出，超声还有助于黄酮类物质的凝聚［17］，从而大大缩短了提取时间，提高提取效率，且对被提取物质不产生破坏作用，因而近年来被广泛用于植物有效成分的提取研究［18］，据报道，超声波辅助提取可以提高山楂叶及果实中黄酮的提取效率［14－19］。芦丁、槲皮素和金丝桃苷为北山楂果实中主要含有的黄酮类化合物［20－21］，本文以北山楂果实为实验原料，以3种黄酮总得率为衡量指标，对山楂黄酮超声波辅助提取工艺进行优化，通过本实验的研究，为北山楂果实中黄酮类化合物的有效开发和利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山楂 市售，产地辽西地区;芦丁和槲皮素标准品(纯度＞97%)购于中国药品生物制品检定所;金丝桃苷标准品(纯度＞98.5%)购于宝鸡市辰光生物科技有限公司;高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

P680型高效液相色谱仪 美国戴安公司;FA2004型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司;RE－2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ－D(Ⅲ)型循环水真空泵 上海申光仪器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超声波细胞破碎仪 宁波新芝超声设备有限公司;PS02－AD－DI超纯水机 上海讯辉环保科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂样品预处理方法 选择整齐度良好的新鲜山楂自来水清洗后去除果核，带皮果肉部分在50℃热风烘干后粉碎成细果粉，全部过40目分样筛后真空封装，冷藏备用。

1.2.2 超声波辅助提取方法 准确称取5g山楂果粉样品于100mL小烧杯中，按照实验设计分别加入适量的乙醇溶液，在相应的超声波功率下提取一段时间后减压抽滤，收集滤液于60℃减压浓缩至膏状后，甲醇溶解并定容至50mL。

1.2.3 液相色谱检测条件 Develosil C30(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱;流动相:A相为乙腈，B相为0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱，80% B～60.5%B(0～26min)，80%B平衡4min后进下一个样品;流速1mL/min;柱温40℃;进样20μL;检测波长:360nm。

1.2.4 标准曲线的绘制 各取芦丁、金丝桃苷和槲皮素标准品48、15和4.5mg，甲醇溶解并分别定容至10mL，得到浓度分别为4.8(芦丁)、1.5(金丝桃苷)和0.45mg/mL(槲皮素)的3种标准品贮备液，分别吸取同体积各标准贮备液，稀释为6个浓度梯度的标准使用溶液，浓度分别为:芦丁，0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 和 0.16mg/mL;金丝桃苷，0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001563mg/mL;槲皮素，0.015、0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg/mL。

1.2.5 山楂黄酮得率的计算方法 山楂黄酮得率(%)=(提取液中3种黄酮浓度总和×定容体积)/(称样质量×100)

1.2.6 提取单因素实验设计

1.2.6.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 在超声波功率为600W条件下，选取液固比为20mL/g和体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作为提取剂超声波辅助提取10min，比较山楂黄酮得率。

1.2.6.2 液固比的影响 在超声波功率为600W条件下，选取体积分数为80%和液固比分别为10、15、20、25、30mL/g的乙醇溶液超声波辅助提取10min，比较山楂黄酮得率。

1.2.6.3 超声波功率的影响 在超声波功率分别为450、550、650、750、850W 条件下，选取体积分数为80%和液固比为20mL/g的乙醇溶液为提取剂超声波辅助提取10min，比较山楂黄酮得率。

1.2.6.4 提取时间的影响 在超声波功率为600W条件下，选取体积分数为80%和液固比为20mL/g的乙醇溶液为提取剂分别超声波辅助提取10、20、30、40、50min，比较山楂黄酮得率。

1.2.7 提取响应面分析实验设计 为进一步确定最佳超声波辅助提取条件和各因素的影响顺序，依据design－expert 7.0进行响应面实验设计，以3种黄酮总得率为考察指标，以乙醇体积分数(X1)、液固比(X2)、超声波功率(X3)和提取时间(X4)为自变量，共设立30个处理组，具体实验设计见表1。

表1 山楂黄酮超声波辅助提取响应面实验设计Table 1 Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid

2 结果与分析

2.1 HPLC分离结果和标准曲线的建立

所配制的标准溶液经0.45μm膜过滤后分别进样，每个浓度进样3次，黄酮混合标准溶液及山楂提取液的液相色谱图见图1－A和图1－B所示，图2提取液中3种黄酮分别采用保留时间和DAD光谱扫描图(图形略)结合定性。从图1－B可以看出，山楂提取液中的槲皮素色谱峰与其它色谱峰效果较好，而芦丁和金丝桃苷没有达到基线分离，但分离度也达到了1.0以上，可用于这2种黄酮定量分析使用。以峰面积为横坐标，3种黄酮浓度平均值(mg/mL)为纵坐标，得到3条标准曲线，标准曲线的回归方程为:芦丁，Y=538.31X－0.3226(R2=0.9999;线性范围为0.0005－0.16 mg/mL)，金丝桃苷，Y=828.86X(R2=0.9996;线性范围为0.0016～0.05 mg/mL)，槲皮素，Y=550.85X+0.044(R2=0.9997;线性范围为0.0005～0.015 mg/mL)。

2.2 山楂黄酮超声波辅助提取的单因素实验结果

图1 黄酮混合标准溶液(A)和山楂黄酮提取液(B)色谱图Fig.1 Chromatogram of flavonoid mixture standard(A)and hawthorn flavonoid extract(B)

2.2.1 乙醇体积分数对山楂黄酮超声波提取得率的影响 乙醇体积分数对山楂黄酮得率的影响如图2所示，乙醇体积分数对山楂黄酮提取效率的影响较大，体积分数为80%的乙醇黄酮得率最高，这与李宁豫等实验结果［14］一致，此时，山楂黄酮类化合物的溶解性最好，其次是90%乙醇，无水乙醇和体积分数较低的乙醇提取效果较差，分析其原因，可能是因为本实验中山楂黄酮提取物主要以芦丁和金丝桃苷两种黄酮苷为主，提取液中槲皮素含量相对较低，在80%～90%乙醇溶液中溶解性高于无水乙醇和体积分数较低的乙醇，提取效果较好，因此选择体积分数为80%的乙醇进行实验。

图2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid yield

2.2.2 液固比对山楂黄酮超声波提取得率的影响液固比对山楂黄酮得率的影响见图3所示，随着液固比的增大，黄酮得率也随之增大。这主要是因为随着液固比的增大，山楂粉末与提取液黄酮的浓度差增大，黄酮类化合物就越容易渗透出来;当液固比增大到一定值后，由于山楂中黄酮类化合物的含量有限，黄酮得率的增加趋于平缓。而且，液固比越大，溶剂的用量增加，后继处理步骤耗能增加，导致提取成本增高，因此，确定液固比25mL/g为最佳。

图3 液固比对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on flavonoid yield

2.2.3 超声波功率对山楂黄酮超声波提取得率的影响 超声波功率对山楂黄酮得率的影响如图4所示，功率增大到550W时，黄酮得率已经达到顶峰，以后随超声波功率的增加黄酮得率逐渐降低，这主要是由于高功率的超声波产生的热效应较强，而高温对黄酮类化合物有一定的破坏作用，又考虑到功率越高，生产成本越高，选择超声波功率550W为最佳。

图4 超声波功率对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on flavonoid yield

2.2.4 提取时间对山楂黄酮超声波提取得率的影响 提取时间对山楂黄酮提取得率的影响如图5所示，从图5看出，超声波在较短的时间内就可以达到较高的提取效率，在20min时，黄酮得率最高，之后随着时间继续增加，得率有下降的趋势，这可能是由于提取时间过长，导致的热效应使得一些黄酮类化合物损失，选择20min进行以下实验。

图5 提取时间对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extracting time on flavonoid yield

2.3 响应面实验设计及结果分析

通过单因素实验，选取乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、提取功率(X3)和提取时间(X4)进行四因素三水平的响应面实验，实验设计的因素、水平和实验结果见表2。用Design－expert 7.0软件对实验数据进行多元回归拟合，得到山楂中黄酮类化合物得率的回归方程如下:

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance results

表2 响应面实验结果及分析Table 2 Experimental results and analysis of the response surface

续表

方差分析结果见表3，由表3可以看出，模型的F值极显著(p＜0.01)，而失拟的F值不显著(p＞0.05)，模型的相关系数R2为82%，说明模型拟合程度较好，实验误差较小，该模型是合适的，因此可以用该模型方程来分析和预测不同超声波辅助提取条件下山楂中黄酮类化合物的得率变化。在所选的各因素水平范围内，四个考查因素对山楂中黄酮类化合物得率影响的顺序为:液固比＞乙醇体积分数＞提取时间＞超声波功率，在所选择的超声波功率范围内，超声功率对山楂黄酮得率没有显著影响(p＞0.05)。

从表3可以看出，液固比和提取时间、超声波功率和提取时间之间存在交互作用，其响应面图和等高线图分别见图6和图7所示。从图6的响应面图可以看出，液固比和提取时间对山楂中黄酮类化合物得率均有较大影响，且随着液固比和提取时间的增加，黄酮得率均呈先增加后变缓的趋势，其中液固比的影响稍大于提取时间，而超声波功率对山楂中黄酮类化合物提取得率影响较小(见图7)。

图6 液固比和提取时间的响应面图Fig.6 Response surface graph of L/S ratio and extracting time

图7 超声波功率和提取时间的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface graph of ultrasonic power and extracting time

通过design expert7.0软件拟合，得出最佳超声波辅助提取山楂黄酮的工艺参数为:乙醇体积分数90%，液固比25.5mL/g，超声波功率600W，提取时间为24.9min，在此优化条件下山楂黄酮得率预测值为0.0352%，实测值为0.0363%，与预测值的相对误差为3.125%，与预测结果相符。

3 结论

建立了以乙腈和0.4%磷酸水溶液为流动相的山楂芦丁、金丝桃苷和槲皮素的分离和定量方法，以3种黄酮得率为响应值，建立了超声波辅助提取山楂黄酮的数学模型，各因素影响的主次顺序为:液固比＞乙醇体积分数＞提取时间＞超声波功率。通过对提取过程工艺的研究，确定了超声波提取山楂黄酮的最佳工艺参数为:乙醇体积分数90%，液固比25.5mL/g，超声波功率600W，提取时间为24.9min，该工艺条件下的山楂黄酮得率为0.0363%，与预测结果相符。

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