袁青彬,郭美婷*,杨 健

(1.同济大学,污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海200092；2.同济大学环境科学与工程学院,上海200092)

污泥负荷对生物处理系统耐药细菌的影响研究
——以活性污泥法中磺胺嘧啶抗性异养菌为例

袁青彬1,2,郭美婷1,2*,杨 健1,2

(1.同济大学,污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海200092；2.同济大学环境科学与工程学院,上海200092)

为了研究污水生物处理工艺中抗药性细菌生长和分布特性及污泥负荷的影响,构建了不同处理负荷的活性污泥工艺,并以磺胺嘧啶抗性异养菌为例,阐述了污泥负荷对活性污泥系统中典型抗药细菌的生长及排放特性的影响.结果表明,污泥负荷增大有利于磺胺嘧啶抗性异养菌的生长繁殖,负荷提高后净比生长速率和细菌产量分别由0.32d-1和2.3×106CFU/d提高至0.33d-1和3.1×106CFU/d,活性污泥、出水和剩余污泥中抗药菌的浓度也均显著提高(P <0.05),但对抗药细菌的相对丰度无显著改变.低污泥负荷下[0.24kg COD/(kg MLSS⋅d)]抗药细菌主要通过剩余污泥形式排放,排放量比(泥中排放量/水中排放量)为28.4;负荷提高至0.4kg COD/(kg MLSS⋅d)后,出水抗药细菌排放量显著提高,排放量比为1.1.处理相同水量,高污泥负荷下排放的抗药细菌总量明显降低,提高污泥负荷有利于活性污泥系统抗药性风险的控制.

活性污泥法；污泥负荷；磺胺嘧啶抗性异养菌；生长；排放

随着抗生素的过度使用,其对环境的影响和危害变得日益严峻,成为近些年研究的热点之一.进入环境中的抗生素可能诱导环境中抗药细菌及其抗药基因的产生[1],而抗药基因也作为一种“新型污染物”被提出,并开始受到重视[2].

污水厂作为各种含抗生素废水的汇集地,含有多种抗药细菌.迄今为止,已在许多国家污水厂中检测到多种抗生素的抗药细菌,其中较为普遍的抗药细菌是大肠杆菌和肠球菌[3-5],抗药基因有抗四环素基因(tetR),抗磺胺类基因(sulR)以及抗青霉素基因(mecA)等[6-8].由于进水水质和工艺条件的不同,各污水厂出水中抗药细菌和抗药基因浓度存在较大差异,检测到抗药细菌最高可达 104CFU/mL,抗 药 基 因 浓 度 可 达105copies/mL.Huang等[9]调查了我国北京地区某污水厂中抗药细菌存在水平,指出污水厂二级出水中对青霉素、氨苄青霉素、头孢金素和氯霉素等抗生素耐受细菌的浓度约在103～105CFU/mL,占总异氧菌群的50%以上.这表明,我国也面临污水抗生素抗性污染的问题,但抗性污染特征尚缺乏基础数据,相关研究仍少见报道.

一些国家和地区针对污水处理工艺对抗药细菌的去除效果已开展了初步的研究.奥地利某污水厂传统活性污泥法对抗药性大肠杆菌的去除率达1.5～2.5log[3];葡萄牙污水厂活性污泥法去除抗药性肠球菌的能力在0.8～1.1log之间[4].不同国家及地区的污水厂对抗药细菌去除效率不同,同一地区或同一工艺处理效果也不尽相同;但总体看来,处理水平在0.5～4.0log之间[10].除了研究污水处理工艺对抗药细菌数量去除或减量效果,少数研究人员还关注了污水处理后抗药细菌的抗药性能.Da Costa等指出,污水处理使得耐环丙沙星的肠球菌的抗药性较处理前增强,使抗药细菌的环境风险进一步加大[4].这意味着污水厂不仅影响抗药细菌数量或浓度,其引起的细菌抗药性能的改变同样值得关注.

污水厂运行条件,如处理工艺、水力停留时间、曝气条件、水力负荷、污泥龄、回流比等,对细菌(包括耐药细菌)的生长繁殖起到关键性的作用,因而可能对其中抗药细菌的分布和去除特性产生影响.针对污水厂中的运行条件等对抗药细菌分布特性的影响已有部分初步的研究.Munir等[11]研究了密歇根5座污水处理厂中不同处理工艺对耐药细菌和耐药基因去除的影响,发现 MBR工艺对四环素和磺胺嘧啶抗药细菌的去除效果显著优于传统活性污泥法,同样,好氧消化和石灰稳定等污泥处置的效果也显著高于传统的脱水和重力沉降等处置方法.Mezrioui和Baleux等[12]的调查表明好氧泻湖对粪肠杆菌的去除率高于污水厂的活性污泥工艺,且泻湖出水大肠杆菌耐药率(35%)高于活性污泥工艺出水(23%).然而目前这方面的研究仍处于较初级的阶段,对于污水厂中运行条件对抗药细菌分布和去除的影响探讨地仍不够深入和全面,有必要针对特定的运行参数开展系统性的研究.

本研究以污泥负荷这一运行参数为例,通过实验室构建活性污泥系统,从抗药细菌的分布、生长和排放特性等方面系统考察污水中较为常见的磺胺嘧啶抗性异养菌的影响.

1 材料与方法

1.1 污水水样

污水水样取自上海市 Q污水厂沉砂池出水段,用25L灭菌聚乙烯塑料桶盛装后15min内运送至实验室进行实验.

1.2 活性污泥系统

1.2.1 反应器设计 主体装置为2个相同的圆柱形有机玻璃反应器(图1),内径14cm,高度26cm,有效容积3.85L,采用磁力搅拌器搅拌,增氧泵曝气.系统以SBR的方式运行.

图1 活性污泥系统示意Fig.1 Schematic diagram of the activated sludge system

1.2.2 反应器启动及运行 反应器的接种污泥取自上海Q污水厂回流污泥,将污泥接种于2个反应器内,至反应器体积的1/3左右,再加入Q污水厂沉砂池出水至顶端刻度线.保持搅拌和曝气并每天更换一次进水.定期监测反应器混合液污泥浓度(MLSS)和污泥沉降比(SV);当 MLSS>1000mg/L,SV在30 %左右后认为污泥驯化完毕.将两反应器污泥混合液充分混合搅拌后均分至A、B两个反应器中.

运行期间,两反应器的运行周期均设置为8h,搅拌器转速为100r/min,DO浓度保持在2～3mg/L,污泥龄均为8d,周期内进水、反应、沉淀、排水4个反应阶段运行时间两反应器保持一致且分别为2,448,25,5min,通过调节进水水力负荷,使得2个反应器的污泥负荷分别为0.24和0.4kg COD/(kg MLSS⋅d).按照上述反应条件运行5周,期间定期监测出水COD、浊度等指标,确保反应器处于稳定运行状态.

1.3 取样及水质分析

在反应器稳定运行5周后开始取样,取样点包括进水,2个反应器活性污泥混合液、出水以及剩余污泥,取样量均为50mL.立即监测其污泥浓度(MLSS)、pH值、浊度、化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、总氮(TN) 总磷(TP)等指标,剩余水样置于4℃保存以用于后续抗药细菌的检测.

pH值采用便携式pH计(pH340i,WTW)测定;浊度采用便携式浊度仪(2100P,HACH)测定;COD 采用COD快速测定仪(DR2800,HACH)测定;SS、NH4+-N、NO3--N、TN、TP和MLSS采用国标中规定的方法进行测定.

1.4 抗性异养菌检测

采用细菌平板计数(标准)的方法检测磺胺嘧啶抗性异养细菌的数目.向灭菌冷却后的营养培养基(牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,琼脂15g/L,pH7.2 ±0.2)中加入一定量的抗生素试剂,使培养基中的磺胺嘧啶浓度达到512mg/L.培养基中磺胺嘧啶的浓度根据 CLSI (2011版)[13]中规定的各种常见病原菌对磺胺嘧啶具有抗药性的标准中最大值确定.分别取一系列浓度梯度稀释后的水样(或泥样)1mL加至含有上述培养基的皮式培养皿中混合,待冷却凝固后放入恒温培养箱中37℃培养24h,统计菌落数在20～300CFU/mL的培养皿,确定磺胺嘧啶抗性异养细菌的数目.每个梯度浓度的样品均设置3个平行样本.此外,将1mL同样梯度稀释操作的上述水样加入不含磺胺嘧啶的营养培养基中同时进行培养计数操作,用来反映水样中的异养菌总数目.

1.5 数据分析

1.5.1 磺胺嘧啶抗性异养菌比例 该比例由磺胺嘧啶抗性异养菌数除以相应的总异养菌数得到.

1.5.2 磺胺嘧啶抗性异养菌净比生长速率采用净比生长速率来描述污泥负荷对磺胺嘧啶抗性异养菌生长的影响.净比生长速率采用式(1)计算.

式中:µnet为磺胺嘧啶抗性异养菌净比生长速率为磺胺嘧啶抗性异养菌浓度变化率,CFU/d;X为SBR混合液中磺胺嘧啶抗性异养菌浓度,CFU/mL;Xin为进水中磺胺嘧啶抗性异养菌浓度,CFU/mL;Xe为出水中磺胺嘧啶抗性异养菌浓度,CFU/mL;Xw为剩余污泥中磺胺嘧啶抗性异养菌浓度,CFU/mL;Qin为日进水量,L/d;Qw为日排泥量,L/d;Qe为日排水量,L/d;V为反应器有效体积,L.

1.5.3 统计分析 统计分析测试采用SPSS19.0进行.利用t-分布来检验数据之间的显著性差异,检验过程在显著性水平为0.05下进行.

2 结果与讨论

2.1 污泥负荷对活性污泥系统中磺胺嘧啶抗性异养菌浓度分布的影响

反应器稳定运行期间主要水质参数见表1.可以看出,尽管两反应器的污泥负荷不同,但它们在好氧条件下进行的有机物降解、硝化反应等都较为充分,说明两反应器运行稳定,且均处于较优的状态下运行,且两个系统对常规指标的去除效果相近,并未因污泥负荷不同而有明显差异.

不同污泥负荷的两反应器系统中各点位磺胺嘧啶抗性异养菌浓度和相对丰度(以所占百分比表示)见图2.进水中磺胺嘧啶抗性异养菌的浓度 为 (4250±250)CFU/mL,所 占 百 分 比 为17.6%±2.6%,由于磺胺类药物价格低廉在水产和家禽养殖使用较广泛[14],较高浓度的磺胺类抗生素在我国包括污水厂和其他水环境中也都有检出[15],这可能导致微生物对磺胺类抗生素的较高抗药率.

表1 活性污泥系统运行过程中常规指标Table1 Regular wastewater quality index in the activated sludge reactors

图2 不同污泥负荷的活性污泥系统各点位耐磺胺异养菌浓度和百分比Fig.2 Concentration and percentage of sulfadiazineresistant bacteria in the activated sludge system with different sludge loading rates

在活性污泥混合液样品中,低污泥负荷样品抗药细菌的丰度相比进水无明显改变,浓度为(5000±1000)CFU/mL,而污泥负荷为0.4的样品浓度显著提高(P<0.05),达到(40000±10000) CFU/mL,为低污泥负荷样品的8倍.在其他运行条件一致的情况下,污泥负荷有利于磺胺嘧啶抗性异养菌在活性污泥系统中的增殖.

污水经处理后反应器出水细菌浓度明显降低(P<0.05),去除率分别达97.6%和97.0%,但活性污泥系统无法完全去除水中的抗药细菌,出水中仍含有较高浓度的磺胺嘧啶抗药异养菌,而且浓度随着污泥负荷的升高而显著升高.高污泥负荷下出水抗药细菌的排放浓度是低污泥负荷的10倍.这表明常规工艺出水是环境中潜在的抗药细菌储存库,后续进一步降低抗药细菌风险的处理方法(如氯消毒、紫外消毒)仍十分必要.

剩余污泥样品由于污泥的浓缩细菌的浓度大大提高,抗药菌浓度也显著高于其他点位,剩余污泥是污水处理系统中抗药细菌排放的重要方式.对比不同负荷下抗药细菌的浓度发现,较高负荷系统中的抗药细菌浓度(101667±7368) CFU/ mL仍高于低负荷(61667±12583)CFU/mL,但此时两者的相对丰度相差不大(分别为18.7%和17.4%)且和进水相比无显著差距.

综合分析污泥负荷对磺胺嘧啶抗药细菌丰度的影响,发现负荷提高使抗药菌在活性污泥、出水和剩余污泥中的浓度均提高.这种提高可能主要是由于负荷提高加快了污泥生长,使抗药细菌在活性污泥系统中的浓度也相应提高,但从抗药细菌的相对丰度看,各点位磺胺嘧啶抗药细菌百分比均不随污泥负荷的提高而发生显著改变(P >0.05),表明污泥负荷不会显著改变活性污泥系统磺胺嘧啶抗药细菌的抗药特性.

2.2 污泥负荷对磺胺嘧啶抗性异养菌生长及排放的影响

采用净比生长速率和细菌产量两项指标来反映系统中磺胺嘧啶抗性异养菌的生长状况.从表2可以看出,高负荷下耐磺胺嘧啶异养菌的净比生长速率略高于低污泥负荷,而产量显著高于后者,表明污泥负荷的提高有利于磺胺嘧啶抗药细菌的生长,这也导致高负荷下系统中包括混合液、出水和剩余污泥各点位的细菌浓度均高于低污泥负荷.相比之下两反应器中异养菌总数的比生长速率分别为0.35和0.38d-1,不同污泥负荷下异养菌总数的生长速率和产量均高于抗磺胺嘧啶异养菌,可能是因为抗性细菌只占总异养菌的一部分,因而产量低于后者,这也导致在混合液中抗性细菌的比例有所降低.

低污泥负荷下磺胺嘧啶抗药菌的排放比高达28.4,说明在负荷较低的条件下绝大部分抗药菌都是通过剩余污泥的方式排放,其在出水中的排放量只占极小的比例,负荷提高后,通过出水排放的抗药细菌量显著提高,已经接近剩余污泥中的排放量(排放比1.1),成为抗药细菌排放的主要方式之一,随着负荷进一步提高,排放比将进一步降低,但进一步增加负荷可能会影响生物处理工艺对常规污染物的去除效果,使出水水质下降.

表2 不同污泥负荷下系统中磺胺嘧啶抗性异养菌生长及排放特性Table2 Propagation and distribution of sulfadiazineresistant bacteria in the activated sludge system with different sludge loading rates

高污泥负荷反应器由于出水抗药性细菌的排放量显著增加,其排放总量也显著升高,从5.9×106CFU/d变为1.8×107CFU/d,但由于此时水力负荷是低污泥负荷下的4倍,相同水力负荷下,高污泥负荷的抗性细菌排放量反而有显著降低(P <0.05),从抗药细菌风险控制的角度来看,负荷提高更有利于抗药细菌的控制.另外,高污泥负荷下排水将成为抗药性细菌排放的重要形式,就我国目前对污水生物处理工艺出水和剩余污泥的后续处理来看,一般污水厂出水还都会经过深度处理或消毒处理后排放,通常对包括抗药细菌在内的各类微生物有比较好的杀灭效果;而剩余污泥处理过程复杂,处理费用较高,一般污水厂不会对其进行十分完善的处理,经过常规的浓缩、稳定、脱水过程后,污泥的抗药性风险可能并未有较明显降低,因而小污泥负荷处理污水不利于抗药性风险的控制.另一方面,发展低排泥量的处理工艺,如采用氧化沟或MBR工艺等,可能有助于控制抗药性风险.当然,本研究仅以磺胺嘧啶抗性异养菌为例考察了其在活性污泥系统中的归趋行为,其他常见抗性细菌在污水生物处理工艺的归趋特性以及可能影响抗药细菌分布的其他运行条件,如曝气条件,污泥龄,水力停留时间等需要在以后的研究中进一步探讨.

3 结论

3.1 污泥负荷增大[0.4kg COD/(kg MLSS⋅d)]使活性污泥系统中混合液、出水和剩余污泥中磺胺嘧啶抗药异养菌的浓度显著提高,分别是低污泥负荷[0.24kg COD/(kg MLSS⋅d)]下的8倍、10倍和1.7倍;但污泥负荷改变对抗药细菌的相对丰度无显著影响.

3.2 污泥负荷的提高有利于活性污泥系统中磺胺嘧啶抗药细菌的生长,净比生长速率和细菌产量分别由0.32d-1和2.3×106CFU/d提高至0.33d-1和3.1×106CFU/d.

3.3 较低污泥负荷下抗药细菌主要通过剩余污泥形式排放,排放比(泥/水)为28.4;负荷提高后,通过出水排放抗药细菌的比例显著提高,排放比(泥/水)达1.1.

3.4 处理单位污水,2种污泥负荷反应器磺胺嘧啶抗药细菌排放量分别为3.3×106CFU/L和2.6×106CFU/L,提高污泥负荷有利于活性污泥系统抗药性风险的控制.

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致谢：本实验的现场采样工作由上海Q污水厂樊工程师等协助完成,在此表示感谢.

《中国环境科学》获评“2012中国最具国际影响力学术期刊”

2012年12月,《中国环境科学》被评为“2012中国最具国际影响力学术期刊”.

“中国最具国际影响力学术期刊”是中国科学文献计量研究中心、清华大学图书馆依据《CAJ国际引证报告》,按2011年度中国学术期刊被SCI期刊、SSCI期刊引用的总被引频次排序并经40多位期刊界专家审议,遴选出的TOP5%期刊.获评“中国最具国际影响力学术期刊”的科技类期刊共156种.统计分析结果表明,从定量分析的角度看,“中国最具国际影响力学术期刊”的国际影响力已经达到国际中等以上水平,跨入了国际品牌学术期刊行列.

《中国环境科学》编辑部

Effect of sludge loading rate on the growth and distribution of sulfadiazine-resistant bacteria.

YUAN Qing-bin1,2, GUO Mei-ting1,2*, YANG Jian1,2
(1.State key Laboratory of Pollution Control and Resource Utilization Research, Shanghai200092, China；2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science,2014,34(8)：1979～1984

In order to study the propagation and distribution of antibiotic-resistant bacteria (ARB) in the typical biological treatment process, an activated sludge system with different sludge loading rates was constructed. The effect of sludge loading rate on the growth and release of sulfadiazine-resistant bacteria in the system was then studied. The results indicated that a higher sludge loading rate promoted the growth of sulfadiazine-resistant bacteria. The net specific growth rate and the bacteria production increased from0.32d-1and2.3×106CFU/d to0.33d-1and3.1×106CFU/d, respectively. The concentration of sulfadiazine-resistant bacteria in activated sludge, effluent and biosolids all increased significantly (P <0.05) with increased sludge loading rate, while the antibiotic resistant characteristic changed slightly. The biosolids was the main released pattern for sulfadiazine-resistant bacteria in the low sludge loading rate [0.24kg COD/(kg MLSS⋅d)] system, and the released ratio (biosolid/effluent) was28.4. By comparison, much more bacteria were discharged through effluent in the higher sludge loading rate [0.4kg COD/(kg MLSS⋅d)] system, with the release ratio (biosolid/effluent) of1.1. The total discharging load decreased significantly in the system with higher sludge loading rate, which was benefical to the potential ARB risk control.

t：activated sludge system；sludge loading rate；sulfadiazine-resistant heterotrophic bacteria；growth；release

X172

：A

：1000-6923(2014)08-1979-06

袁青彬(1987-),男,山东临沂人,博士研究生,研究方向为污水中耐药细菌及耐药基因的分布特性与归趋.

2013-11-21

上海市自然科学基金(13ZR1443300);国家自然科学基金(51308399)

*责任作者, 讲师, guomeiting@tongji.edu.cn