杜昭平，马成杰，华宝珍，徐爱才，徐志平，马爱民

（1.乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

非消化性寡糖（Nondigestible oligosaccharides，NDOs）是一类不能在哺乳动物上消化道被分解或吸收的寡糖类碳水化合物[1]，大部分非消化性寡糖进入消化道后段后可以选择性地刺激大肠中的一种或几种有益细菌的代谢和繁殖，从而对宿主健康产生有益功效，因此也被称为益生元（Prebiotics）[2]。研究表明，低聚果糖[3]、低聚半乳糖[4]、菊粉[5]以及棉籽糖、水苏糖[6]都可作为双歧因子（Bifidus factor）促进哺乳动物肠道内双歧杆菌的生长，抑制致病菌的生长，调节肠道菌群平衡，改善肠道菌群微环境[7]，因此多数非消化性寡糖被作为功能性食品配料，用于各类保健益生功能食品的研究与开发[8-9]。

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC2W（CGMCC No.0828）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III（CGMCC No.0847）在模拟人体消化环境中具有较强的耐受性和优异的存活性能[10]，降高血压、降低胆固醇、控制体重[11]等益生功能明显，具备良好的应用开发潜力，但L.casei LC2W在牛乳中生长比较缓慢，L.plantarum ST-III在牛乳中产酸能力很弱，不能凝乳[12]，这些因素成为限制L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在发酵乳制品工业中的规模化应用的瓶颈。本研究通过验证不同的非消化性寡糖对L.casei LC2W和L.plantarum ST-III的体外增殖促进效应，为这两株益生菌在发酵乳制品中的应用和合生元产品的开发提供一定的技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂乳粉（蛋白质含量33.4%）：新西兰恒天然公司；非消化性寡糖及其来源低聚果糖（Fructo-Oligosaccharide，FOS）、低聚半乳糖（Galacto-Oligosaccharide，GOS）、菊粉（Inulin）：江门量子高科生物工程有限公司；低聚木糖（Xylo-oligosaccharide，XOS）：山东龙力生物科技有限公司；低聚异麦芽糖（Isomal tooligosaccharide，IMO）：保龄宝生物股份有限公司；棉子糖（Raffinose）：北京中棉紫光生物科技有限公司；水苏糖（Stachyose）：西安菲德生物科技有限公司。酪蛋白胨、牛肉膏、酵母抽提物：北京奥博星生物技术有限公司；所有试剂均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 菌种与培养基

菌种：L.casei LC2W、L.plantarum ST-III（冷冻干燥菌粉）：光明乳业股份有限公司。

MRS 培养基[13]：酪蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 8.0 g，酵母抽提物4.0 g，葡萄糖20.0 g，K2HPO42.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，NaAc 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，Tween801mL，溶于蒸馏水中并定容至1000mL，121℃高压灭菌15 min。

MRS-NDOs培养基：分别将MRS培养基中的葡萄糖等量替换为表1所示的各种非消化性寡糖，其余配方同MRS培养基。

Glucose-free MRS培养基：将MRS培养基中的葡萄糖除去，其余配方同MRS培养基。

1.3 仪器与设备

Bactron-I培养箱：美国Shellab公司；SA-300VF高压蒸汽灭菌器：德国Sturdy Industrial公司；UV-1800分光光度计：日本Shimadzu公司；GFL1002恒温水浴锅：德国GFL公司；868型pH计：美国Thermo Orion公司；5804R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化与菌悬液制备

将适量L.casei LC2W和L.plantarum ST-III冷冻干燥菌粉分别接种于MRS液体培养基中，转接活化2次～3次后，经4 000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀，经灭菌生理盐水洗涤2次后制成菌悬液，于4℃下保存备用[14]。

1.4.2 益生菌在MRS-NDOs液体培养基中的生长曲线

以1%的接种量，分别接种L.casei LC2W和L.plantarum ST-III菌悬液于 MRS、MRS-NDOs和 Glucose-free MRS液体培养基中，37℃静置培养12 h。培养过程中，以未接种的液体培养基为参照，每小时测定一次样品在600 nm波长下的吸光值OD600。

1.4.3 NDOs对益生菌发酵脱脂牛乳的影响

1.4.3.1 不同NDOs对益生菌在脱脂乳中繁殖产酸的影响

分别向浓度为12%的脱脂牛乳中添加表1所示的8种非消化性寡糖，使其终浓度为1%。充分搅拌溶解后，95℃水浴杀菌30 min，待冷却至37℃时，以3.0×106CFU/mL的接种量，接种L.caseiLC2W或L.plantarum ST-III菌悬液，混匀后于37℃静置发酵24 h，发酵结束后测定发酵乳中益生菌菌落总数、乳酸含量及pH。

1.4.3.2 NDOs添加量对益生菌在脱脂乳中增殖的影响

选取对益生菌发酵脱脂乳具有明显促进作用（P＜0.01）的非消化性寡糖，分别以 0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%和5%的添加量加入脱脂牛乳中，经杀菌、冷却、接种，于37℃静置发酵24 h后，测定发酵乳中益生菌菌落总数。

1.4.4 数据检测与分析

参照食品安全国家标准GB/T 4789.35-2010《乳酸菌检验》的方法测定发酵乳样品的L.casei LC2W和L.plantarum ST-III菌落总数，参照GB/T 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》的方法测定发酵乳样品的乳酸含量，使用Orion868 pH计测定发酵乳的pH；利用SPSS 13.0 for Windows软件进行数据统计分析，Origin 8.0软件进行数据作图。

2 结果与分析

2.1 两株益生菌在MRS-NDOs液体培养基中的生长曲线

L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在不同碳源的MRS液体培养基中的吸光值如图1和图2所示。

L.casei LC2W在MRS-GOS和MRS-Inulin中的生长曲线与在MRS培养基中的生长曲线基本一致，意味着L.casei LC2W能够有效利用GOS和Inulin作为碳源进行增殖；L.casei LC2W对IMO和FOS的利用效率次之，而几乎无法以Raffinose、XOS和Stachyose为唯一碳源进行生长繁殖，培养期间吸光值的微弱上升可能是由于非消化性寡糖中残存的部分可利用的碳源维持了L.casei LC2W的缓慢增殖[15]。

图1 L.casei LC2W在不同碳源的MRS培养基中的生长曲线Fig.1 Growth curves of L.casei LC2W in MRS medium with different carbon sources

图2 L.plantarum ST-III在不同碳源的MRS培养基中的生长曲线Fig.2 Growth curves of L.platarum ST-III in MRS medium with different carbon sources

L.plantarum ST-III对Inulin和Raffinose的利用效率最高，其生长曲线与在MRS培养基中的生长曲线基本一致；但对IMO的利用效率最低，其生长曲线与在Glucose-free MRS培养基中的生长曲线基本相同；以 XOS、Stachyose、FOS 和 GOS 为唯一碳源时，L.plantarum ST-III生长较缓慢，说明L.plantarum ST-III对上述碳源的利用效率不高。

2.2 NDOs对两株益生菌在脱脂乳中繁殖产酸的影响

质量分数为1%的非消化性寡糖对L.casei LC2W和L.plantarum ST-III在脱脂乳中的增殖具有不同的影响。如表1所示，添加GOS和Inulin后，与对照组相比，L.casei LC2W发酵乳的pH值和乳酸含量差异显著（P＜0.05），L.casei LC2W菌数对数值差异极显著（P＜0.01），其余非消化性寡糖对L.casei LC2W的增殖作用不明显（P＞0.05）。

如表2所示，GOS和XOS均对L.plantarum ST-III在脱脂乳中的增殖具有促进作用，菌数对数值、发酵乳pH和乳酸含量有显著差异（P＜0.05）；而FOS的添加仅使发酵乳pH和乳酸含量有显著差异（P＜0.05），L.plantarum ST-III菌数对数值无明显差异（P＞0.05）；Raffinose和Inulin对L.plantarum ST-III在脱脂乳中的增殖促进作用最为明显，菌数对数值、发酵乳乳酸含量及pH均与对照组差异极显著（P＜0.01）。

表1 NDOs对L.casei LC2W在脱脂乳中增殖的影响Table 1 Influence of NDOs on the proliferation of L.casei LC2W in skim milk

表2 NDOs对L.plantarum ST-III在脱脂乳中增殖的影响Table 2 Influence of NDOs on the proliferation of L.plantarum ST-III in skim milk

2.3 NDOs添加量对益生菌在脱脂乳中繁殖产酸的影响

选取对L.casei LC2W发酵脱脂乳具有明显促进作用（P＜0.01）的GOS和Inulin，以及对L.plantarum ST-III发酵脱脂乳具有明显促进作用（P＜0.01）的Raffinose和Inulin，分别以不同的浓度添加到脱脂乳中，其对两株益生菌的增殖促进效果如图3和图4所示。

图3 NDOs添加量对发酵乳中L.casei LC2W菌数的影响Fig.3 Influence of NDOs addition on the colony account of L.casei LC2W in fermented milk

图4 NDOs添加量对发酵乳中L.plantarum ST-III菌数的影响Fig.4 Influence of NDOs addition on the colony account of L.plantarum ST-III in fermented milk

当添加量在0.2%～3%的区间范围内时，发酵乳中L.casei LC2W菌数随着GOS和Inulin的添加量的增加而迅速上升；添加量超过3%后，菌数反而呈下降趋势，这可能是由于高浓度的非消化性寡糖在培养基中形成了较高的渗透压，因而对益生菌的生长繁殖产生了抑制作用[16]。因此，GOS或Inulin添加量为3%时，对L.casei LC2W在脱脂乳中的生长促进效应最佳。

随着Raffinose和Inulin添加量的增加，发酵乳中L.plantarum ST-III菌数一直呈上升趋势。当Raffinose和Inulin添加量低于2%时，ST-III菌数随添加量增加而迅速升高；随着添加量的继续增加，L.plantarum STIII菌数上升幅度明显减缓，而高浓度的Raffinose和Inulin并未对L.plantarum ST-III的生长繁殖产生明显的抑制作用，这可能是由于ST-III菌株的抗渗透压能力较强。考虑到添加成本，Raffinose和Inulin的最佳添加量为2%。

舒国伟等[17]的研究表明，Stachyose和GOS可以促进两歧双歧杆菌BB01的体外增殖，XOS对BB01菌株的生长没有影响，而李艳丽等则报道XOS对乳酸杆菌的增殖效果非常明显，XOS添加量为0.2%时对乳酸杆菌的增殖作用达311%，添加量进一步增加时反而会抑制乳酸杆菌的生长[18]。由此可见，不同益生菌菌株对非消化性寡糖发挥体外增殖效应具有一定的选择性。这种选择性可能是由菌株的生理生化特性决定的[19]。

3 结论

GOS和Inulin对L.casei LC2W在MRS-NDOs液体培养基和脱脂乳中的增殖具有极显著的促进作用（P＜0.01）；GOS和XOS可以显著促进L.plantarum STIII在脱脂乳中的增殖（P＜0.05），而对 L.plantarum STIII增殖促进作用最显著的是Raffinose和Inulin（P＜0.01），其余非消化性寡糖对这两株益生菌的体外增殖促进效应较弱，甚至不能发挥促进作用。

非消化性寡糖促进L.casei LC2W和L.plantarum ST-III体外增殖的最佳添加浓度不同，GOS和Inulin促进L.casei LC2W的最佳浓度为3%，且高浓度会产生抑制效应；Raffinose和Inulin促进L.plantarum STIII的最佳浓度为2%。

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