刘冰，许程剑，*，王月香，孙然，牛博楠，卢士玲，李应彪

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子832000；2.石河子大学第一附属医院老干一科，新疆石河子832000）

阿魏菇又名阿魏侧耳、阿魏蘑，因其生长在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子实体具有很高的营养价值和药用价值。据报道[1-2]阿魏菇属高蛋白、低脂肪、高碳水化合物、高纤维素营养食品。其中多糖含量在10%以上，阿魏菇中所含的多糖是重要的生物活性成分，具有增强人体免疫力，减少辐射危害、抗肿瘤调节人体生理平衡等作用。多糖的生物活性决定于其自身结构，了解多糖的基本组成和简单结构是研究多糖药理活性的理论基础。近几年，有关阿魏菇多糖的研究较少，原子力显微镜（AFM）观察阿魏菇多糖分子的微观结构也未见报道[3-5]。本实验对阿魏菇多糖进行提取、分离纯化，通过薄层色谱分析单糖组成，并利用红外光谱和原子力显微镜对纯化分级的多糖结构进行了研究，这为系统的研究阿魏菇多糖的组分、结构及进一步弄清其构效活性关系提供了理论参考，在功能性食品的开发和阿魏菇的深加工等方面具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阿魏菇（新疆清河）；DEAE-Cellulose和Sephadex G-100（Pharmacia公司）；浓硫酸、苯酚、苯胺、邻苯胺、无水乙醇、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、正丁醇、过硫酸铵、阿里新兰染色液、氯化钠、氢氧化钠、溴化钾等均为国产分析纯。

FDU-1200真空冷冻干燥机：上海精宏试验设备有限公司；Ultrospec-5300紫外分光光度仪：日本岛津公司；ZXRD-7080鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；D36mm透析袋（XH419）：北京鼎国生物技术有限责任公司；ENK-PRO酶标仪：美国Bio-teck生产；HX-DBS-100电脑全自动部分收集器：京恒奥德仪器仪表有限公司；ZD11-WD121红外分析仪器：北京中西化玻仪器公司；KQ-200VDE双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HL-1恒流泵：苏州江东精密仪器有限公司；Nano-R2原子力显微镜：上海实密国际贸易有限公司；GRX-9073A热空气消毒箱：上海一恒科技有限公司；Neofuge15R高速冷冻离心机：力康发展有限公司；DYY—Ⅲ6B电泳仪：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 阿魏菇粗多糖制备

挑选新鲜阿魏菇，剪碎并打浆后，在超声辅助下[6]热水浸提5 h，4层纱布过滤，然后离心除去杂质，收集滤液，浓缩到适当体积。经Savage法除蛋白[7]，然后加入4倍体积、浓度为100%的乙醇，在4℃下醇沉时间12 h。所得沉淀用75%乙醇洗涤2次，然后用60℃蒸馏水溶解，离心去除杂质，取上清液继续醇沉，所得絮状沉淀物质即为阿魏菇粗多糖。继续加水溶解，透析2 d后冷冻干燥得阿魏菇总多糖。

1.2.2 阿魏菇多糖的分离与纯化

1.2.2.1 多糖的凝胶层析

将冷冻干燥得到的多糖20 mg溶解到5 mL蒸馏水里，6 000 r/min离心10 min，取上清液过凝胶柱DEAE-Cellulose，用不同浓度的NaCl洗脱[8]，并用全自动数据收集器收集洗脱液。然后用苯酚-硫酸法[9]测定每管多糖含量。将获得的组分真空冷冻干燥后，再通过Sephadex G-100时用蒸馏水洗脱，并收集洗脱液，同样方法测多糖含量。

1.2.2.2 多糖小分子的脱除

粗多糖中含有各种分子量大小的杂质，包括一些小分子物质，而多糖自身的分子量较大。透析膜可以通过膜内外溶液的浓度差实现物质交换，依浓度梯度从浓度高的一侧向浓度低的一侧移动，而水分子则按渗透梯度从渗透浓度低的一侧流向渗透浓度高的一侧，因此多糖去蛋白液中的小分子物质能通过膜迁移到溶液中去，大分子物质则留在膜内，从而将阿魏菇多糖小分子脱除。

1.2.2.3 多糖得率计算

式中：C为根据吸光度计算出的葡萄糖浓度，（mg/mL）；V为不同的液料比比值；N为旋转蒸发后稀释的倍数；M为阿魏菇样品的重量，g。

1.2.2.4 单因素试验

根据已有研究[6]，选择影响多糖得率的几个因素：超声时间、超声温度、超声功率、液料比进行单因素实验，分别考察各因素对阿魏菇多糖得率的影响。并以此为试验因子，进行正交设计。

1.2.3 阿魏菇多糖的分析鉴定

1.2.3.1 多糖的薄层色谱分析

多糖的水解[10]：取纯化后样品10 mg于安瓿瓶中，加入2 mol/L的H2SO45mL，密封，振荡至样品完全水解，然后置于110℃烘箱中反应12 h，反应完成后冷却至室温，加BaCO3中和，在3 000 r/min的离心机中离心取上清液备用。采用薄层色谱法标准操作规程，薄层板以含3%CMC和3%的硅胶G铺板，展开剂为正丁醇：丙酮：水（4∶3∶1），将水解后的多糖与标准单糖在薄层板上每隔1.5 cm用毛细管点样，吹干后室温下置层析缸内自下向上展开，当展开剂到达离薄层板顶端约1 cm处取出薄层板，前沿做记号，60℃烘干2 h～3 h（或者薄层板在空气中晾干）后喷洒苯胺-邻苯胺显色剂，于110℃烘箱中加热10 min，根据不同单糖的显色颜色不同和展开距离不一样来判断多糖中单糖的组分。

1.2.3.2 多糖的紫外光谱分析

将多糖配置成浓度为500 mg/mL的水溶液，用紫外光谱仪测定波长200 nm～400 nm的紫外光谱。

1.2.3.3 多糖的红外光谱分析

将干燥的分离纯化阿魏菇多糖组分1mg于洁净的玛瑙研钵中，在红外灯下研磨成细粉，再加入约100mg干燥的KBr一起研磨至二者完全混合均匀，颗粒粒度约为2 μm以下。取适量的混合样品于洁净的压片模具中，制成透明试样薄片，要求压片不可太厚。以不加多糖样品的KBr为空白，同样方法制样片。将试样薄片装在磁性样品架上，放入红外光谱仪的样品室中，在400 cm-1～4 000 cm-1区间进行红外光谱扫描，先测空白背景，再将样品置于光路中，测定样品红外光谱，进行修正，观察谱峰情况。

1.2.3.4 多糖原子力显微镜（AFM）观测

准确称取1mg分离纯化的组分。配制成20 μg/mL多糖溶液，冷却至室温，再稀释至2 μg/mL。用移液枪吸取3 μL多糖溶液，滴在新鲜解离的云母片上，空气中干燥大约20 min，待样品干燥后即可进行原子力显微镜（AFM）观测。

1.2.3.5 多糖凝胶电泳测定

SDS-聚丙烯酰胺凝胶法：将阿魏菇多糖C溶解于蒸馏水中，配成5 mg/mL的多糖溶液，备用。配制5%分离胶和3%的浓缩胶并处理样品溶液，衡压40 v进行电泳，再以阿里新兰染色。

2 实验结果与分析

2.1 透析

根据预实验结果，选用截留分子量为8×103～1.2×104的透析袋进行透析，可以达到理想的效果。

2.2 单因素试验结果

根据进一步实验研究表明超声时间70 min、超声功率160 W、超声温度60℃、液料比为30∶1为最佳工艺，阿魏菇多糖的平均得率为11.08%[6]。

2.3 多糖组分纯化

图1为阿魏菇总多糖通过DEAE-Cellulose后，苯酚-硫酸法测定每管多糖的含量而得。

图1 阿魏菇多糖DEAE-Cellulose洗脱图Fig.1 Mushrooms polysaccharide on DEAE-52 elution diagram

由图1可以看出，洗脱曲线有两个峰，表明阿魏菇总多糖经过DEAE-52分离纯化出两种组分，分别命名为A、B。对图1所得的A、B组分进行收集合并冷冻干燥，所得样品进行Sephadex G-100的凝胶层析柱，得到两个洗脱峰，见图2。

图2 阿魏菇多糖Sephadex G-100洗脱图Fig.2 Mushrooms polysaccharide Sephadex G-100 elution diagram

同样收集合并经冷冻干燥得纯品阿魏菇多糖命名C。多糖是大分子化合物，即使是纯品，其微观也是不均一的。它的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均配布。同时，根据聚电解质效应，考虑到多糖组分在水中可能有弱的电离，浓度越低电离度越大，大分子所带电荷越多，促使原来蜷曲的大分子键伸展开来；另外，溶液越稀，水分子越易向大分子内部扩散，使其体积膨胀。大分子团的膨胀和分子键的伸展造成了洗脱体积的增大。这也说明了采用不同方法检验多糖纯度是必要的。

2.4 薄层色谱分析结果

薄层色谱分析结果见图3。

图3 阿魏菇多糖薄层色谱分析图Fig.3 TLC analysis of mushrooms polysaccharide

图中1至6点样分别是葡萄糖、果糖、样品、半乳糖、木糖、甘露糖。通过薄层色谱分析，对比于各单糖的展开效果及显色效果，结果表明总多糖可能是由半乳糖，葡萄糖，果糖，甘露糖组成。有研究表明[11]，一些多糖的抗肿瘤活性强弱与其甘露糖含量呈现正相关，但是对于降血糖活性是否存在这样的关系有待进一步考证。本实验通过综合对比几种分析多糖的单糖组成成分的方法，最后采用TLC法，其操作简单，快速，但由于多糖水解成单糖后其极性相近，因此有可能会达不到理想效果，有待进一步研究。

2.5 多糖的紫外扫描结果

多糖的紫外扫描结果见图4。

图4 阿魏菇多糖紫外光谱图Fig.4 The UV spectrum of mushrooms polysaccharide

由图4可知，阿魏菇的多糖紫外光谱为典型的多糖光谱，在260、280 nm处无吸收峰，表明无核酸、蛋白质等杂质。

2.6 多糖红外分析结果

多糖红外分析结果见图5。

图5 阿魏菇多糖红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of mushrooms polysaccharide

阿魏菇多糖C组分用KBr压片法，在400 cm-1～4 000 cm-1区间内摄得红外光谱，主要吸收峰有3 417.8、2 926.7、1 738.6、1 643.6、1 152.5、1 025.7 cm-1，通过红外图谱可以看出，在3 417.85 cm-1处有强峰值，表明有多糖分子间或分子内的氢键，是O-H的伸缩振动峰，由于羟基形成氢键，吸收峰变宽，2 926.7 cm-1处有一中强强吸收峰，为糖链中次甲基（-CH2-）C-H伸缩振动引起，在这个区域的两组吸收峰是糖类的特征峰；在 1 738.6 cm-1和1 643.6、1 026.7 cm-1和1 152 cm-1的吸收峰是吡喃糖环的两种C-O伸缩震动引起的，其中一种属于C-O-H，另一种属于糖环的CO-C。

2.7 多糖原子力分析结果

多糖原子力分析结果见图6。

图6 阿魏菇多糖AFM分析图Fig.6 AFM analysis of mushrooms polysaccharide

从纯品阿魏菇多糖组分AFM分析图像中可以看出多糖分子链呈现出分枝结构，糖链的密度依赖于其初始密度及其沉积到云母片表面的量；图像的对比度依赖于针尖的作用力，作用力太大易损坏糖链，而太小则对比度差，难得到较清晰、稳定的图像。从图像中可以看到，多糖分子链及其多个侧链结构，这些侧链结构链间通过单元间不同的链接方式衍生出环状结构，而链呈多股紧密的螺旋状结构可能与多糖中分子间的Vander Waals相互作用以及糖链间氢键缔合有关。

2.8 多糖电泳结果

多糖电泳结果见图7。

图7 阿魏菇多糖电泳结果图Fig.7 Electrophoresis results of mushrooms polysaccharide

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明，阿魏菇多糖呈区带相对集中。阿魏菇多糖C为均一组分，达到了电泳纯级的样品。

3 结论

本文以阿魏菇为研究对象，对其粗多糖的制备，多糖的分离与纯化，多糖的纯度鉴定进行了系统的研究，同时利用薄层分析法，红外分析，电泳，AFM等一系列方法分析研究其多糖的组分及结构。阿魏菇总多糖进行除蛋白后，通过薄层色谱分析出总多糖可能由半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖组成，通过DEAE-52 Cellulose凝胶柱及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化出阿魏菇纯品多糖C。将多糖C进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，表明其为均一组分。同时进行了红外光谱和原子力分析，表明阿魏菇多糖分子具有高度分枝的结构。

4 讨论

阿魏菇是新疆特有的菌类之一，来源丰富，阿魏菇多糖的提取分离具有一定的可信性和可行性。多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性在肿瘤的治疗和预防上优于其它化合物，因此多糖作为药品或保健食品的应用将有广阔前景。随着对多糖生物活性的研究，尤其是糖组学的进一步深入，多糖的生物活性机理、功效因子会更加明确，它的应用领域将会更加拓宽。

有关本实验的多糖研究方法还有很多，不同的研究方法可能会得到部分的差别，由于时间和条件的限制，本试验只是初步的研究，还有待进一步的研究与探讨。

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