彭维，李双祁，欧爱芬

（1.广州医科大学，广东广州510182；2.广州绿萃生物科技有限公司，广东广州510530；3.广州市药品检验所，广东广州510160）

皂甙（saponins），是广泛存在于植物界的一类特殊的甙类，在植物界分布很广，许多中药例如人参、三七、知母、远志、甘草、桔梗、柴胡等都含有皂苷。皂苷由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成[1]。有许多含皂苷类成分的中药如远志、桔梗等有祛痰止咳的功效[2]；有些皂苷还具有抗菌的活性或解热[3]、镇静[4]、抗癌等有价值的生物活性[5-6]。在皂苷类成分的提取物中，往往伴随着诸如糖类、鞣质等亲水性较强的成分，给皂苷类成分的分离纯化增加了难度[7]。因皂苷的苷元部分多为疏水性，能被非极性树脂所吸附，同时由于皂苷分子较大，故孔径较大的D-101型大孔吸附树脂为理想的选择[8]。吸附后，很容易用水将糖类等亲水性成分洗脱下来。再用适宜浓度的乙醇溶液将吸附在树脂上的皂苷类成分洗脱，达到分离纯化的目的[9]。目前，大孔吸附树脂法提取分离皂苷已被广泛应用，如人参总皂苷[10]、三七总皂苷[11]、绞股蓝总皂苷、毛冬青总皂苷等的提取分离。

传统的比色法测定总皂苷含量时，一般只用大孔吸附树脂对样品进行纯化、富集处理，很少对其进行脱色，而大孔吸附树脂法只能去除提取液中的糖类、鞣质和淀粉等杂质，对色素的去除不理想，造成结果存在一定误差。为了使实验结果更接近于真实值，总皂苷的脱色纯化处理成为重要一步。

1 试剂与仪器

1.1 材料

御和坊海狗丸（批号：20120101）；人参皂苷Re对照品，由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 仪器与试剂

U-3010 紫外可见分光光度计（HIACHI，Japan）、KUDOS超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司；SG-4050型系列数显恒温水浴锅：上海硕光电子科技有限公司。

D-101大孔吸附树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司；D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂：山东鲁抗医药有限公司；层析用中性氧化铝：上海纳辉干燥试剂厂，AR；95%乙醇（AR）、无水乙醇（AR）、甲醇（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR）、香草醛（AR）：广州化学试剂厂。

2 方法

2.1 纯化方法的比较

取海狗丸适量粉碎，精密称取0.5 g试样，置于50 mL容量瓶中，加适量蒸馏水，超声提取30 min，再用蒸馏水定容至50 mL，摇匀，放置。

2.1.2 纯化

分别精确吸取1.0 mL已处理好的试样溶液（2.1.1），分别过D-101大孔吸附树脂柱、D-101大孔吸附树脂和氧化铝柱、D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱，先用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，然后用25 mL 70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中。

2.1.3 对照溶液的制备

精密称取一定量的人参皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分别吸取人参皂苷Re对照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 放蒸发皿上，按2.1.4置于60℃水浴挥干，进行测定，绘制标准曲线。线性关系为y=0.0016x+0.0719，R2=0.9986。

2.1.4 测定

将2.1.2的纯化洗脱液置于60℃水浴挥干，在已挥干的蒸发皿中准确加入0.2 mL 5%的香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后移入10mL带塞刻度离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后，以1 cm比色池于560 nm波长处测定其吸光度。根据标准曲线计算总皂苷的含量。

2.1.5 回收的制定

很多教师在课堂练习中没有将新课程标准的相关理念与实际教学相结合，只注重书面练习，其他形式相对缺乏，如社会实践题、口头练习和动手练习等；在课堂练习中单纯注重基础知识和基本技能的训练，缺少思维训练，未能认识到学生个人思维的重要性。

精确吸取1.0 mL已处理好的试样溶液，另加对照品溶液（0.2mg/mL）1.0 mL与试样一起纯化测定。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系考察

精密称取一定量的人参皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分别吸取人参皂苷Re对照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，过 D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱，先用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，然后用25 mL 70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中。按2.1.4置于60℃水浴挥干，进行测定，绘制标准曲线。

2.2.2 精密度考察

精密吸取人参皂苷Re标准液（0.2 mg/mL）1.0 mL放蒸发皿上，水浴挥干（低于60℃），或热风吹干（勿使过热），加适量蒸馏水溶解，过D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱，收集洗脱液于蒸发皿中，按2.1.4测定，测定6次，计算其RSD%值。

2.2.3 重复性考察

取试样0.5 g，按“2.1.1预处理”后，精确吸取1.0 mL已处理好的试样溶液，过D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱，收集洗脱液于蒸发皿中，按2.1.4测定。分别进行6次平行试验。

2.2.4 加样回收试验

精密吸取重复性考察时预处理好的试样1.0 mL，共取 9 份，分别精密加入标准液（0.2 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL（60℃以下挥干），配成高、中、低浓度试液各三份。过D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱，收集洗脱液于蒸发皿中，按2.1.4测定。

2.2.5 稳定性考察

取重复性考察处理好的供试品液于0、2.5 h与5 h分别测定其吸光度值。

3 结果与讨论

3.1 纯化方法比较

表1 3种纯化方法测定总皂苷含量及其回收率Table 1 The content of total saponins and its recovery of the three purification method

由于保健食品所含成分较为复杂，测定其中的总皂苷含量易受糖分、鞣质、色素等成分的干扰。由表1看出，只经D-101吸附树脂纯化的试样，所测得样品总皂苷含量最大，经D-101吸附树脂和氧化铝纯化的次之，经D-101吸附树脂与D-941离子交换树脂纯化的最小，而经D-101与D-941树脂的回收率最好，平均回收率达97.02%，其他两种纯化工艺的回收都欠佳。表明D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂除去保健食品中色素等其他杂质效果良好，而且不影响总皂苷含量，适用于保健食品中总皂苷含量测定的除杂与纯化。

3.2 方法学可行性分析

3.2.1 线性关系考察

试验结果图1表明，人生皂苷Re检测质量在0.02 mg～0.4 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为：y=0.001 6x+0.071 9，R2=0.998 6。

图1 标准曲线Fig.1 The standard curve

3.2.2 精密度考察

表2 精密度试验结果（n=6）Table 2 Precision of test results

由表2试验结果可见，6次测定结果的RSD值为0.27%，用D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱联用纯化样品的测定方法精密度较好。

3.2.3 重复性考察

表3 重复性数据Table 3 Repeatability data

由表3试验结果可见，6次测定结果的RSD值为0.79%，用D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱联用纯化样品的测定方法重复性较好。

3.2.4 加样回收试验

表4 加样回收数据Table 4 Recovery test data

由表4的试验结果可见，用D-101大孔吸附树脂柱和D-941大孔弱碱性阴离子交换树脂柱联用纯化样品的平均回收率为98.62%，RSD值为1.66%（n=9），证实了该方法能有效地用于保健品中总皂苷的含量测定。

3.2.5 稳定性考察

结果表明，其吸光度在5h内人生皂苷Re及样品溶液的吸光度变化很小，稳定性好，平均RSD为1.21%。

表5 稳定性数据Table 5 Stability data

4 结论与讨论

保健食品中所含成分复杂，易对测定结果产生干扰。本实验所用海狗丸主要原料为海狗精粉、人参、淮山药、茯苓、熟地、淫羊藿、肉桂、淀粉硬脂酸镁等，除皂苷外还含有大量的色素等其他杂质。本实验过程中，试液过D-101大孔吸附树脂后的洗脱液呈黄色，吸光度值最大，而过加氧化铝的D-101吸附树脂的洗脱液颜色相对较淡，吸光度次之，表明氧化铝有一定的脱色作用，但脱色不完全；过D-101吸附树脂后的洗脱液再过D-941离子交换树脂，洗脱液呈现无色透明，其吸光度值最小，表明D-941离子交换树脂的脱色效果明显。而且从这3种纯化方法的加样回收来看，前两种的回收率分别为94.86%和92.34%，回收率较低，而过D-941离子交换树脂的试样回收率达97.02%，远高于前两种。表明D-941离子交换树脂脱色能力强，且不会吸附总皂苷，适用于保健食品中总皂苷的脱色纯化处理。

本实验用D-101大孔吸附树脂与D-941离子交换树脂柱联用对保健食品中的总皂苷进行脱色纯化处理，以人参皂苷Re为对照品做校正曲线，线性关系良好，标准曲线为：y=0.001 6x+0.071 9（R2=0.998 6，n=5），加样回收率为 98.62%，RSD=1.66%，精密度，重复性好，可作为保健食品中总皂苷测定的方法，对保健品质量的控制具有重要的意义。

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