宋薇，宋桂雪，李荣斌，陈晓旭，赵永彪

（谱尼测试科技股份有限公司，北京100080）

近年来，随着添加有无根剂、植物生长激素、漂白剂、抗菌剂、尿素等非食用成分的毒豆芽不断有报道，豆芽的食用安全引起大家的密切关注和评论。尿素原可作为食品工业加工助剂，见GB2760-2007版《食品添加剂使用卫生标准》，但在GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中已不包括尿素。国家标准GB 22556-2008《豆芽卫生标准》只笼统规定了食品添加剂的品种和使用量应符合国标GB 2760的规定，其它也只规定了铅、亚硫酸盐和微生物的限量。豆芽的地方标准中，如四川省DB 51/T 1061-2010《豆芽》、北京市DB 11/377-2006《豆芽安全卫生要求》、青岛市DB 3702/T 090-2006《豆芽生产管理技术规范》和浙江省DB 33/625.2-2007《无公害豆芽质量安全要求》等标准中对豆芽的理化指标限量较多，也只规定了重金属含量、农药、兽药残留的限量，对尿素含量限量没有规定。

目前，尿素的检测方法主要有两类：第一类是比色法，如二乙酰一肟比色法、对二甲氨基苯甲醛比色法、邻苯二甲醛比色法、丁二酮肟比色法检测食品中的尿素[1-3]；第二类是液相色谱法（HPLC）。然而由于豆芽基质比较复杂，且本身带有颜色，采用比色法测定，易造成假阳性，致使结果发生偏差。HPLC法中，用溶剂直接提取样品，采用反相C18柱，二极管阵列检测器在紫外区域190 nm～205 nm或将尿素衍生后利用荧光检测器（FLD）检测化妆品、土壤、尿液、红酒、黄酒中的尿素含量[4-8]，利用HPLC法检测豆芽中的尿素未见报道。豆芽中尿素的检测，常见的比色法，然而由于豆芽基质比较复杂，且本身带有颜色，采用比色法造成假阳性，致使结果发生偏差。

呫吨氢醇，又称9-羟基呫吨、占顿醇，是一个传统的测定尿素肥料的试剂，如ISO 8603：1993测定固体肥料尿素态氮含量的测定就用呫吨氢醇重量法，在醋酸溶液中，尿素中的酰胺与呫吨氢醇生成二呫吨脲沉淀。然而尿素也可以和呫吨氢醇生成具有荧光效应的9-脲基呫吨[7]，本文利用该原理对豆芽中尿素进行衍生，建立了测定豆芽中尿素的HPLC-FLD法，并对市售豆芽和实验室自发豆芽进行了检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪（配G1321B荧光检测器）：美国安捷伦公司；家用多功能粉碎机：上海昂尼公司；Vertex Genie 2涡旋混合器：美国Scientific Industries公司；CT15RT高速冷冻离心机：上海天美公司；DHP恒温培养箱：江苏麦普龙公司。

呫吨氢醇标准品（Xanthydrol，纯度98%）：美国Alfa Aesar公司；尿素（高纯试剂，J&K）：Chemical公司；无水乙醇、盐酸、无水乙酸钠均为分析纯，水为一级水。

呫吨氢醇衍生试剂：称取0.404 g呫吨氢醇，用无水乙醇溶解并定容至100 mL，配制4.04 mg/mL呫吨氢醇溶液，避光冷藏备用，有效期3个月。

尿素标准储备液：准确称取尿素标准品10 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，并定容至刻度，得到质量浓度为1 mg/mL的尿素标准储备液，4℃保存，有效期3个月；将尿素标准储备液用无水乙醇稀释成适当质量浓度的标准工作液，4℃保存，有效期3个月。

试样：实验室自发豆芽所用的绿豆和黄豆均购自大型超市，在实验室经40℃左右温水浸泡3 h～4 h后，然后转入底部带孔的塑料托盘中，放入37℃恒温培养箱培养，每天换水3次～4次，发芽时间3 d～4 d不等。袋装贴有绿色食品标志豆芽（简称绿色豆芽）采购于超市，分别选取3种不同企业的产品。散装豆芽采购自集贸市场和超市。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的选择

采用AgilentEclipseXDB-C18柱，150mm×4.6mm，5 μm。流动相：A为乙腈；B为0.02 mol/L乙酸钠溶液；流动相梯度洗脱：从0～12 min，A由20%递增到50%，B由80%递减到50%；从12 min～13 min，A由50%递增到100%，并保持5 min。流速为1.0 mL/min。荧光检测器激发波长λex=213 nm，发射波长λem=308 nm；进样量 10 μL；柱温 35℃。

1.2.2 标准曲线的绘制

将尿素标准液分别稀释成质量浓度为1、2、5、10、25、50 mg/L的标准系列，分别取300 μL尿素标准液，加入300 μL呫吨氢醇溶液和20 μL一定浓度的稀盐酸，避光衍生反应，衍生产物用HPLC-FLD进行检测。

然后根据峰面积与质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。

1.3 样品制备

1.3.1 样品前处理

豆芽用食品粉粹机粉碎均浆。精确称取试样2 g（精确到0.000 1g）于50 mL塑料离心管中，加入无水乙醇，定容至10 mL。振荡提取30 min后离心8 000 r/min 5 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤备用。

1.3.2 衍生

取300 μL滤液，加入氢醇溶液和稀盐酸，依照1.2.2步骤和本文优化后的条件衍生后上机检测。

2 结果与讨论

2.1 衍生试剂

在酸性条件下，尿素和呫吨氢醇生成衍生产物9-脲基呫吨（9-Carbamido xanthydrol），经 HPLC 分离后荧光检测器检测。我们将该原理应用于豆芽中尿素的检测，且对衍生产物进行荧光检测，可以有效避免比色法中豆芽其他有机成分对尿素的严重干扰。荧光检测器检测波长采用λex213 nm，λem308 nm[7]。尿素和呫吨氢醇的反应式见图1。

图1 尿素与呫吨氢醇的反应式Fig.1 The reaction of urea and xanthydrol

2.2 反应的特异性

呫吨氢醇一般与具有酰胺结构的分子发生反应。虽然豆芽发芽过程会产生游离的氨基酸[9]，但我们实验确认，常见的18种游离氨基酸（L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-醋酸赖氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-盐酸半胱氨酸、L-谷氨酸）不与该衍生试剂反应，对结果没有影响。原因在于这些氨基酸分子中不含酰胺结构。对那些具有酰胺结构的氨基酸，液相色谱中保留时间不一致，也对结果没有影响；如常见于西瓜、南瓜中具有酰胺结构的瓜氨酸，其呫吨氢醇的衍生产物与尿素的的保留时间不同，分别在6.1和9.8 min附近。因此该方法的特异性强，没有干扰。

2.3 样品前处理的优化

分别试验了水和乙醇做提取溶剂。经试验发现采用乙醇做提取溶剂，尿素能很好地溶于乙醇，同时对含蛋白质较高的豆芽可以有助于沉淀蛋白，避免浑浊，降低干扰。在文献中测定红酒、尿液、黄酒中的尿素时衍生试剂采用了正丙醇[7，8]，我们考察了无水乙醇和正丙醇配制衍生试剂对实验结果的影响；结果表明，乙醇作为溶剂时，尿素衍生产物响应值比正丙醇稍高。考虑到样品处理也采用乙醇提取，因此本文采用无水乙醇作为提取溶剂和配制衍生试剂的溶剂。

2.4 衍生条件的优化

2.4.1 盐酸浓度和用量的影响

试验证实，不加盐酸时，衍生反应不发生，故没有荧光衍生产物生成。固定衍生试剂和衍生反应时间，我们考察了盐酸用量对衍生产物峰面积的影响，结果见图2。

图2 不同尿素浓度和盐酸用量条件下衍生产物峰面积的关系图Fig.2 Relationship of different urea contents and hydrochloric acid amount on peak areas of derivatives

对相同浓度的尿素，峰面积随着盐酸用量的增加而下降，且下降幅度随着尿素浓度的升高而增加。因此，为了得到较高的仪器响应，应减小的用量。分析原因可能部分尿素在酸性条件下与呫吨氢醇发生竞争反应，与盐酸生成铵离子而分解造成。

2.4.2 衍生时间的选择及衍生产物稳定性

在衍生试剂浓度和盐酸体积不变的条件下，用10 μg/mL的尿素标准液，分别加入10 μL 1.5M稀盐酸溶液，考察了衍生时间对衍生产物峰面积的影响。衍生时间分别试验了 10、20、60 min 和 1.5、2、3 h 和 5 h，结果见图3。

图3 不同衍生时间对衍生产物峰面积的影响Fig.3 Relationship of derivative time on peak areas of derivatives

结果表明，随着衍生时间从10 min到20 min时，衍生产物快速反应，峰面积快速增加，然而增加趋势从20 min变缓，到2 h时，能达到峰值。我们也试验了0.15 M盐酸条件下，衍生反应时间对峰面积的变化。发现峰面积对相同条件下1.5 M盐酸的峰面积高3倍以上，但2 h时衍生反应间还在增长，18 h才能达到稳定。为了缩短测试时间，综合考虑，最后确定衍生条件用1.5 M盐酸，盐酸用量20 μL，衍生时间2 h。

2.4.3 衍生试剂用量的选择

当保持尿素体积（300 μL）、1.5 M盐酸溶液用量（20 μL）不变时，试验了呫吨氢醇用量对衍生反应的影响，结果见图4。

图4 不同尿素浓度和呫吨氢醇用量条件下衍生产物峰面积的关系图Fig.4 Relationship of different urea contents and xanthydrol amounts on peak areas of urea derivatives

尿素浓度分别为2、10、50 μg/mL条件时，呫吨氢醇用量从10 μL增加至200 μL，衍生产物峰面积逐渐升高，达到 200 μL～300 μL时，峰面积可以达到最大。通过计算反应式（图1）中呫吨氢醇和尿素的摩尔数关系是1∶1；200 μL 4.04 mg/mL 呫吨氢醇的摩尔数是 4×10-6mol，300 μL 50 μg/mL 尿素的摩尔数为 2.5×10-7mol。呫吨氢醇用量在200 μL～300 μL时，物质的量过量16倍～24倍，因此该反应中呫吨氢醇需要充分过量。本实验最后确定呫吨氢醇300 μL作为衍生剂用量。

2.5 定性与定量分析

2.5.1 定性分析

在本文建立的色谱条件下，尿素衍生产物保留时间为9.85 min，峰形对称、尖锐，附近没有干扰峰。尿素标准品和黄豆芽色谱图见图5。

图5 尿素衍生产物标准溶液（a）和黄豆芽样品（b）色谱图Fig.5 Chromatograms of urea derivative standard（a）and yellow soybean sprout sample（b）

根据保留时间定性分析，样品中目标物色谱峰的保留时间与标准溶液相比在±2.5%的允许偏差之内。

2.5.2 线性范围和检出限

在建立的色谱条件下对质量浓度为1.0 μg/mL～50 μg/mL的尿素标准液的衍生产物进行测定，以尿素质量浓度为横坐标（X），衍生产物的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到线性回归方程为Y=120.4X+28.4，相关系数R2为0.999 7。以S/N=3作为本方法的检出限，本方法检出限为0.5 mg/kg。

2.5.3 精密度和准确度

将含尿素7.6 μg/mL黄豆芽溶液连续进样6次，测定积分峰面积，RSD%为1.5%，说明仪器精密度良好，满足分析要求。测定自发绿豆芽尿素含量为3.57 mg/kg；用该样品进行加标实验，加标量为10、50、100 μg，即加标浓度分别为5、25和50 mg/kg，每个浓度水平平行测定6次，结果见表1。

表1 尿素加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and RSD%of urea in the samples

加标回收率分别为98.5%～106%之间，RSD%在3.2%～4.0%，该方法精密度和准确度满足分析要求。

2.6 实际样品检测

选取市售豆芽、绿色食品标签豆芽和自发豆芽为实际样品，按“1.4”条件对样品中的尿素进行检测，每个样品平行测定两次，结果见表2。

表2 豆芽中尿素含量测定实验数据Table 2 Urea contents in different types of soybean sprouts

结果发现自发豆芽含量在（7.27±4.4）mg/kg（n=6），绿色食品标签豆芽尿素含量（8.1±1.9）mg/kg（n=4）。绿色食品标签豆芽和自发豆芽结果相近，两者之间的差异可能与豆子的品种、发芽时间、含水量等因素有关系。市售散装豆芽中尿素含量相差较大，从7.6到148mg/kg不等，平均值 49.3±31.5mg/kg（n=35）。自发豆芽和绿色食品标签豆芽中含有较低含量的尿素，可能来源于豆芽生长过程中蛋白质代谢；而尿素含量较高的豆芽有人为添加的嫌疑。进一步的研究将确定尿素的本底值与豆的种类、发芽方法、发芽时间之间的关系。

3 结论

在酸性条件下9-羟基呫吨和尿素反应，可以生成有荧光特性的衍生产物。本文建立了高效液相色谱-荧光检测法检测豆芽中的尿素，该法前处理操作简便快捷，在优化的条件下，尿素的检出限为0.5 mg/kg，加标回收率98.5%～106%，且RSD小于4%，可满足定量分析的需要，方法简便、灵敏、准确，适用于豆芽中尿素含量的检测。

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