蔡 莉

（江阴职业技术学院化纺系，江苏 江阴，214433）

近几年随着制药企业GMP的实施，臭氧灭菌效果的监测日益受到重视，可供选择的监测方法很多，如化学指示剂法、留点温度计法等，但较为可靠的方法为采用生物指示剂［1］，即用某些特异的菌种作为指示菌，根据其是否被杀灭作为消毒灭菌的指标。无菌检查是无菌产品质量控制的一个重要指标。但无菌检查时常采用抽样检查，而微生物污染是非均匀污染，由于抽样的概率问题，生产过程中产品灭菌效果不符合要求往往难以用无菌检查结果反映出来，除非是较严重污染的情况［2］。因此，产品的无菌保证不能依据终产品的无菌检查结果，而需要通过生物指示剂的挑战试验来监控。

在微生物挑战性试验中，传统的检验臭氧消毒效果是用枯草芽孢杆菌来检测，但实践证明枯草芽孢杆菌作为检测的生物指示剂存在着较多的缺点，其杀菌率达不到微生物挑战性试验的标准要求。因此为提高检测的灵敏度，本文分别考察两种生物指示剂，在不同的臭氧消毒时间、臭氧浓度、环境温度等条件下，以环境中的菌体残留量（杀菌率）作为指标来检测杀菌效果，从而优选出对臭氧较为敏感的生物指示剂。进而对选出的生物指示剂进行微生物挑战性试验验证［3－4］，选出更为合适的生物指示剂。

1 材料与方法

1.1 材料

金黄色葡萄球菌（北京四环卫生药械厂有限公司）、枯草芽孢条（上海宝录生物科技有限公司），分别取上述菌液1ml，用pH值＝7.0的缓冲液稀释为原来的10－4，控制菌种数在50－100cfu／ml之内；臭氧消毒器（河北冠宇环保设备制造有限公司；生化培养箱（上海博讯室业有限公司）。

1.2 方法

在洁净区相应的功能间内，将已稀释好的枯草芽孢杆菌菌悬液和金黄色葡萄球菌菌悬液（稀释级别为10－4）1ml分别滴加到空培养皿内，每个功能间放两平皿，使菌悬液平摊分布满整个平皿，每个房间放置培养皿时需考虑工作区域和最差情况点（如气流组织不易到达的角落和容易积尘不易清洁的死角）。打开臭氧消毒器，控制臭氧浓度15－20ppm、温度20－25℃、消毒四小时。消毒结束后向平皿中注入15ml 40℃左右的营养琼脂培养基混匀，待培养基冷凝后培养若干小时后观察计数。同时以两个菌悬液平皿放置相同的时间后注入琼脂冷凝后做阳性对照，并向两个空白平皿注入营养琼脂做为空白对照。以上培养皿均放入生化培养箱中，温度控制在30－35℃，培养72h后对微生物进行计数。本文以杀菌率作为指标来比较臭氧对生物指示剂的杀灭效果。杀菌率的计算公式为：杀菌率＝（对照组菌数－消毒组菌残存数）／对照组菌数×100%。

2 实验结果

2.1 不同臭氧消毒环境对两种微生物指示剂的影

响

分别考察不同的臭氧消毒时间、臭氧浓度、环境温度对两种生物指示剂杀菌率的影响，从而得到对臭氧消毒较为敏感的生物指示剂。

2.1.1 臭氧消毒时间对两种生物指示剂的影响

分别考察不同臭氧消毒时间（1h、2h、3h、4h、5h）下，对两种生物指示剂的生长影响，结果见图1。

图1 臭氧消毒时间对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌杀菌率的影响

由图1可知，臭氧对金黄色葡萄球菌的杀菌率大于对枯草芽孢杆菌的杀菌率，其作为生物指示剂灵敏性更优于枯草芽孢杆菌，因此选取臭氧消毒最佳时间为2小时。

2.1.2 臭氧浓度对两种生物指示剂的影响

分别考察不同的臭氧消毒浓度（2ppm，6ppm，8ppm，10ppm，15ppm，20ppm）对两种生物指示剂生长的影响，具体结果见图2。

图2 臭氧浓度对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌杀菌率的影响

由图2曲线可知，金黄色葡萄球菌的最高杀菌率仍高于枯草芽孢杆菌，说明金黄色葡萄球菌作为生物指示剂其敏感性要优于枯草芽孢杆菌，因此宜选择臭氧消毒浓度为15ppm。

2.1.3 消毒时环境温度对两种生物指示剂的影响

研究不同的消毒温度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃）对两种生物指示剂杀菌率的影响，具体结果见图3。

图3 消毒时环境温度对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌杀菌率的影响

由图3可知，用金黄色葡萄球菌作为生物指示剂，当消毒时环境温度为20℃时，对金黄色葡萄球菌的杀菌率达到最高，其杀菌效果比较明显。因此宜选择20℃作为臭氧消毒灭菌的环境温度。

通过以上不同条件下对两种生物指示剂杀菌率的比较，发现金黄色葡萄球菌的灵敏性优于枯草芽孢杆菌，但其杀菌率是否能达到微生物挑战性试验的要求，尚需进一步验证。

2.2 对金黄色葡萄球菌做生物指示剂的验证

臭氧消毒前对十万级无菌室做浮游菌检测，并在臭氧消毒后再次检测浮游菌，得出杀菌率。同时在杀菌时用金黄色葡萄球菌作为生物指示剂来检测臭氧消毒能力，并计算其杀菌率。

比较以上两个杀菌率，如果杀菌率相似（相差5%，达到微生物可接受标准），则说明金黄色葡萄球菌能作为臭氧消毒的生物指示剂。

表1 浮游菌检测记录

表2 金黄色葡萄球菌检测检测记录

根据公式计算，得出金黄色葡萄球菌杀菌率为91.6%，浮游菌杀菌率为92.94%，其偏差在可接受标准之内。故金黄色葡萄球菌能作为微生物挑战性试验的生物指示剂，可用于检测臭氧消毒的效果。

3 结论

本文创新性的选择金黄色葡萄球菌作为生物指示剂，与传统的生物指示剂——枯草芽孢杆菌进行比较，通过试验得到当臭氧消毒时间2h、臭氧消毒浓度为15ppm、环境温度20℃时，用金黄色葡萄球菌做生物指示剂灵敏性要优于枯草芽孢杆菌做生物指示剂，同时其杀菌效果符合微生物挑战性实验的要求，因此可作为监测臭氧消毒效果的生物指示剂。

［1］安玉梅，周存英，刘相娟.两种生物指示剂对压力蒸汽灭菌器生物监测的影响［J］.当代护士，2010（10）：154－155.

［2］黄程兰，刘敏，陈滢.臭氧在污水处理中的应用［J］.四川化工，2012（1）：25－28.

［3］苏敏.臭氧空气消毒的临床应用［J］.实用医药杂志，1998，11（1）：66.

［4］龚海燕，张明，李倩.灭菌生物指示剂与指示微生物［J］.环境卫生学杂志，2013，3（4）：170－174.