王青松，胡晓倩

（北京大学生命科学学院 生物基础教学实验中心，北京 100871）

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一种在美国西北海岸生长的名为Aequorea victoria的维多利亚水母中发现的蛋白质。GFP全长共238个氨基酸，分子量约为27kDa，它的发光核心是由第65至67个氨基酸（丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸）残基组成的结构域，可自发地形成一种荧光发色团，在波长395 nm的紫外光激发下可产生绿色荧光［1－4］。自1962年日裔科学家下村修在维多利亚水母中发现绿色荧光蛋白至今，GFP已经广泛应用于蛋白质表达纯化、蛋白质相互作用、蛋白质细胞内定位示踪和模式生物转基因等生物学研究中［5－8］。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对蛋白质进行电泳分离，是生物学研究中广泛使用的实验技术。蛋白质免疫印迹技术（western blotting）是利用抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的经典的对复杂体系中靶蛋白定性和半定量的技术，蛋白质经高分辨率SDS－PAGE分离并将蛋白质转印到膜上进行免疫化学分析，在生物学研究中广泛使用［9－11］。蛋白质质谱分析技术自2002年获诺贝尔化学奖以来的10多年时间里飞速发展，在蛋白质鉴定、定量和翻译后修饰分析方面发挥了非常关键的作用，是现代生物学研究中的前沿实验技术［12－13］。为提高学生的实验技能，本实验选择GFP作为实验对象，设计包括GFP的原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDS－PAGE电泳分离、免疫印迹和质谱鉴定等内容的生物化学综合实验，增强实验的综合性和研究性。

1 实验材料与试剂

镍亲和介质购自美国GE Heathcare公司；Blue plus蛋白质相对分子质量标准购自北京全式金生物技术有限公司（包含6种已知相对分子质量的标准蛋白质，16kDa～94kDa）；兔抗GFP多克隆抗体在中国科学院动物所制备；羊抗兔二抗购自北京集思佳扬生物科技有限公司；NaCl、KCl、Tris、glycine、乙醇、甲醇、磷酸、SDS、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 和碳酸氢铵购自北京化学试剂公司；脱脂奶粉购自内蒙古伊利集团；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；考马斯亮蓝G－250、Tween－20和胰蛋白酶购自美国 Merck公司；PVDF膜购自美国Bio－rad公司；胰蛋白胨、酵母提取物、咪唑、IPTG、乙腈和甲酸购自美国Sigma公司。

2 实验仪器

恒温摇床（北京北方同正生物技术发展有限公司）；台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器厂）；玻璃层析柱（内径1cm×长10cm，自制）；蛋白核酸检测仪及记录仪（美国GE Heathcare公司）；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪（美国ThermoFisher公司）；SE250小型垂直板电泳槽及电源（美国GE Heathcare公司）；凝胶成像仪（法国Vilber Lourmat公司）；脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；金属浴（北京金银杏生物科技有限公司）；Trans－Blot Turbo蛋白转印系统（美国Bio－rad公司）；LTQ Orbitrap质谱仪（美国ThermoFisher公司）。

3 实验方法

3.1 摇菌/诱导表达

从－80℃保存的含有pET28a－GFP质粒的表达菌种中挑取少量碎冰菌屑，接种于含有7mL的LB液体培养基（10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10 g/L氯化钠，100mg/L卡那霉素）的小试管中，37℃摇床200r/min培养过夜；取2mL过夜培养的菌液放入500mL的LB培养基的培养瓶中，摇床200r/min培养至OD600值为0.8时加入终浓度为100mg/L的IPTG，放入37℃中6h诱导GFP的表达。

3.2 裂解提取

将诱导表达GFP后的菌液在4℃、7 000 g离心20min，弃去上清后，加入40mL的裂解缓冲液（30 mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5），放入－80℃冰箱2h以上；取出融化后用超声破碎菌体，超声10s、停5s，超声30次后放置5 min，再次超声30次。于20 000 g、4℃离心20min后取上清。

3.3 镍柱亲和纯化

使用裂解缓冲液（30mmol/L Tris，10mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）平衡镍柱5个柱体积后开始上样；上样后用裂解缓冲液洗2～5个柱体积洗去杂蛋白；然后用含有30mmol/L咪唑的缓冲液（30 mmol/L Tris，30mmol/L 咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗杂蛋白2～5个柱体积；最后用含有250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液（30mmol/L Tris，250mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.5）洗脱至紫外吸收峰走平为止；收集洗脱液，用10kDa的50mL的Millipore超滤离心管超滤除去咪唑，将溶液置换为30mmol/L的Tris缓冲液（pH 8.5），分装冻存于－80℃［9］。

3.4 荧光光谱扫描分析

利用Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪测定纯化后GFP的激发光波长与发射光波长。将100μL的GFP溶液（质量浓度2g/L）加入96孔板中，放入多功能读数仪，选择荧光连续光谱扫描方式。首先固定激发波长为470nm，设置扫描发射波长范围为470～600nm，扫描波长间隔为2nm，运行发射光扫描，得到最佳发射光检测波长。根据检测结果固定最佳发射光波长，再进行激发光谱扫描，设置扫描激发波长范围300～500nm，扫描波长间隔为2nm，运行激发光扫描，得到最佳激发光检测波长。根据检测结果可得到GFP样品的激发光谱与发射光谱。

3.5 SDS－PAGE凝胶电泳

配制5%的浓缩胶和12.5%的分离胶。上样后样品进入浓缩胶时的电压为100V；待样品进入分离胶后，将电压调为150V，待指示染料迁移至下沿约1cm处停止电泳；电泳后，将凝胶取出，把凝胶分为两部分，分别用于考马斯亮蓝染色和蛋白转印。将一部分凝胶放入容器中，加入考马斯亮蓝G－250染色液（0.01%考马斯亮蓝G－250，5%乙醇，8.5%磷酸），摇床温和振荡，染色1h。染色完毕，倾出染色液，用水漂洗数遍凝胶，再加入脱色液（0.25mol/L KCl）。其间更换2～3次脱色液，直至凝胶的蓝背景褪去、蛋白质带清晰为止［9－10］。

3.6 Western blotting

将SDS－PAGE凝胶电泳分离蛋白质的另一半凝胶用蛋白质转印系统将蛋白质半干转印到PVDF膜上。将用转膜缓冲液（2.9g/L glycine，5.8g/L Tris，0.37g/L SDS，20%甲醇）浸透的凝胶和滤纸按照由下而上按顺序摆放（滤纸、PVDF膜、胶、滤纸），形成4层转印体系，设置20V、1.0A、20min；用含有5%脱脂奶 粉 的 PBST 溶 液 （8g/L 的 NaCl，3.6g/L 的Na2HPO4·12H2O，0.24g/L 的 KH2PO4，0.2g/L的 KCl，0.1%的 Tween－20，pH 7.4）室温封闭1h。一抗为兔抗GFP多克隆抗体，用含有5%脱脂奶粉的PBST按照1∶3 000稀释。用稀释后的一抗4℃孵育过夜后用PBST洗涤10min，重复3次。羊抗兔二抗用含有5%脱脂奶粉的PBST按照1∶5 000稀释，室温孵育1h。PBST洗涤10min，重复3次后，DAB法显色。待清晰的条带出现后，用dH2O洗膜2次。

3.7 胶内酶切与质谱鉴定

将SDS－PAGE凝胶上的GFP条带切割到EP管内，加入脱色液（25mmol/L的碳酸氢铵，50%的乙腈）；待条带上的颜色脱干净后，吸去脱色液，每孔加入100μL无水乙腈脱水30min后弃去乙腈；加入约10 ng胰蛋白酶（2.5ng/μL稀释于25mmol/L碳酸氢铵中），4℃吸涨约45min，37℃酶解12～16h；加入100 μL含有0.1%TFA、50% 乙腈的萃取液，37℃摇床摇晃萃取肽段1h，使用抽干机抽干肽段13。肽段用10 μL、0.2%的甲酸溶解，使用 LTQ Orbitrap质谱仪进行分析鉴定，纳升液相以乙腈－0.1%甲酸为流动相，乙腈由0min的5%梯度升至30min的35%进行肽段洗脱，流速为500nL/min。

4 结果

4.1 镍柱亲和纯化GFP层析图谱

将绿色荧光蛋白CDS序列连入到带有6×His标签的载体上构建pET28a－GFP表达载体，在原核大肠杆菌BL21中表达后使用镍柱亲和纯化GFP蛋白。层析洗脱后有特异的亲和洗脱峰流出，层析后得到的GFP蛋白有明显的绿色荧光，表明得到了较纯的GFP蛋白（见图1）。

4.2 荧光光谱扫描分析图谱，标出吸收峰

GFP最大的特点是具有荧光发光基团，荧光光谱分析表明，纯化的GFP蛋白的最大激发波长480nm，最大发射波长500nm，与已知的GFP的荧光光谱基本相同（见图2）。

图1 原核表达GFP蛋白的层析图谱

图2 纯化得到的GFP蛋白的荧光光谱扫描分析

4.3 利用电泳图谱计算GFP的相对分子质量

利用SDS－PAGE凝胶电泳对GFP蛋白进行分离及考马斯亮蓝G－250染色，通过蛋白质条带观察到亲和纯化GFP的效果好，并经过计算得到GFP的相对分子质量约为27kDa，与理论值吻合，见图3（a）。

4.4 Western blotting免疫印迹图谱

Western blotting免疫印迹实验通过蛋白转印仪将GFP蛋白从SDS－PAGE凝胶上转印到PVDF膜上后，经过一抗和二抗反应后，使用DAB方法对GFP条带进行显色。结果表明，免疫印迹膜上具有很特异的GFP蛋白条带，表明GFP蛋白的表达和纯化成功，见图3（b）。

4.5 GFP蛋白的质谱鉴定结果

质谱鉴定实验通过将GFP蛋白条带从SDSPAGE凝胶上切割下来，经过脱色、脱水及胰蛋白酶酶切后得到肽段，使用LC－MS/MS质谱进行蛋白质质谱鉴定。结果表明，鉴定到19个GFP蛋白的肽段，序列覆盖率为74.37%（见图4）。

图3 纯化得到的GFP蛋白的SDS－PAGE电泳和免疫印迹结果

图4 GFP蛋白的LC－MS/MS质谱鉴定结果

5 结论

（1）本实验从绿色荧光蛋白的原核蛋白表达、镍柱亲和纯化到纯化的GFP蛋白的免疫印迹和LCMS/MS质谱鉴定，是学习蛋白表达、纯化与鉴定的综合性实验，内容完整，是一个很好的综合性实验。

（2）实验对象（绿色荧光蛋白）是生物学研究中的重要工具，实验过程中能加强学生对GFP发现发展的历史及其在生物研究中的相关应用的学习和理解。

（3）镍柱亲和纯化蛋白质、SDS－PAGE凝胶电泳及Western blotting免疫印迹实验是生物学研究中广泛使用的重要实验技术，通过实验，能让学生全面完整地掌握这些常用的实验技术，学习各种生化仪器的使用。

（4）蛋白质质谱鉴定是现代生物学研究中研究生物大分子的重要前沿技术。由于质谱仪器昂贵，该实验的质谱分析部分利用北京大学生命科学学院质谱测试平台完成。该实验内容属于提高实验，使本科生有机会接触到前沿的生物学实验技术，开拓学生的视野，提高参加科学研究的兴趣。

该综合实验适应新形势下实验教学的需要，在原有生物化学实验的基础上，密切结合当前的生物学研究，并利用北京大学生命科学学院特色科研平台的优势，对现有实验内容进行改革和创新，对于开展具有自我特色和创新的生物化学综合实验教学具有重要意义。

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