缪 静 殷曰彩 冯志彬 程仕伟

MAO Jing YIN Yue－cai FENG Zhi－binCHENG Shi－wei

（鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025）

（College of Life Science，Ludong University，Yantai，Sandong 264025，China）

无花果果实皮薄无核，肉质松软，风味甘甜，营养丰富，含有人体所需的18种氨基酸，尤以抗疲劳的天门冬氨酸（1.9%干重）含量最高，另外，维生素 A、E、C及硒、锌、钙等矿物质含量也极其丰富［1］。无花果具有较高的药用价值，中医学［2］认为，具有滋养、健脾、开胃、清热、润肠、解毒、消肿、降血压等功效；无花果还含有大量的膳食纤维、果胶等成分，可驱除人体内的铅，降低胆固醇和血糖，对心、脑血管硬化及糖尿病具有治疗作用，还可降低肝脏中的酯质含量，对脂肪肝有一定的疗效［2－4］。本研究采用成熟无花果为材料，此时果实含糖量及枸橼酸等有机酸含量最高，有利于微生物的生长及提高出醋率。

无花果果醋的研究论文、专利及产品虽然有见出现，但是数量很少，且工艺条件的优化也仅仅做了单因素及正交试验［5］。Design Expert软件在质量控制、管理和科研领域应用较多，但在果醋培养条件优化方面的研究未见报道。本研究拟利用Design Expert软件，在单因素试验的基础上，通过响应面法对无花果醋的发酵条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

活性干酵母：湖北安琪生物集团；

醋酸菌：鲁东大学生命科学学院保藏。

1.1.2 原料和试剂

无花果：烟台产；

蔗糖：食品级，市购；

果胶酶：2万U／g，诺维信酶制剂公司；

酵母粉、蛋白胨、琼脂：生化试剂，北京奥博星生物技术有限公司；

水杨酸、酒石酸钾钠、NaOH：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要设备

旋转式摇床：HZQ－Q型，哈尔滨东联电子技术公司；

紫外—可见分光光度计：Agilent 8453型，安捷伦科技公司上海分公司；

生化培养箱：LRH－280型，广东省医疗器械厂；

高压灭菌锅：LS－C50L型，江阴滨江医疗设备厂；

发酵罐：5BGZ－2002型，上海保兴生物工程设备公司；

手持糖度计：VBR90A型，杭州汇尔仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 酵母菌活化 用2%（m／V）的葡萄糖加入1%（m／V）安琪活性干酵母，敞开，30℃下连续搅拌，活化约30 min，直至糖水中出现大量微小气泡［6］。

1.2.3 酒精发酵 将无花果鲜果破碎榨汁后，调整果汁中还原糖含量至17%（m／V）左右，接入活化的酵母菌，于26℃发酵。酒精发酵过程中测定酒精度，当酒精度达到7%（V／V）左右时，终止酒精发酵转入醋酸发酵［7，8］。

1.2.4 醋酸发酵 将100 m L无花果酒液装入500 m L三角瓶，接入醋酸菌，置于旋转摇床在一定温度和转速下发酵，每隔12 h测酸度一次，至酸度不再上升时结束发酵［9，10］。

1.2.5 单因素试验 选取转速、温度、接种量、发酵时间4个因素做单因素试验，并选取对无花果醋发酵影响较大的因素做下一步的优化试验。在温度为32℃，接种量5%，发酵5 d的条件下，设置摇床转速分别为160，180，200，220，240 r／min进行醋酸发酵确定最适转速；在转速为200 r／min，接种量5%，发酵5 d的条件下，分别于28，30，32，34，36℃进行醋酸发酵确定最佳发酵温度；在温度为32℃，转速200 r／min，发酵5 d的条件下，采用3%，5%，7%，9%，11%的接种量进行果醋发酵选择最有利于果醋发酵的接种量；在温度为32℃，接种量5%，转速200 r／min的条件下，分别在果醋发酵的第3、5、7及9天取样测定醋酸浓度确定果醋最佳发酵周期。过程中以醋酸浓度和转化率作为评价指标。

1.2.6 优化试验 采用Box－Behnken设计进行试验设计，采用Design Expert 8.0软件进行数据处理和回归分析，对无花果醋发酵工艺进行优化［11，12］。

1.2.7 测定方法

（1）总酸：采用NaOH滴定法；

（2）挥发酸：采用蒸馏法；

（3）酒精度：采用重铬酸钾比色法；

（4）糖度：用糖度计测定；

（5）还原糖（以葡萄糖计）：采用水杨酸试剂比色法［10］。

（6）醋酸转化率：按式（1）计算。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验优化无花果醋发酵工艺

2.1.1 转速对无花果醋发酵的影响 氧气为醋酸菌生长繁殖及醋化乙醇所必需，培养系统的溶氧量将直接影响醋酸的发酵，在摇瓶装液量一定的情况下系统溶氧主要受摇床转速的影响［10］，随着转速的增加溶氧会随之增加。由图1可知，摇床转速为200 r／min时醋酸产量及转化率最高，过高或过低的转速均不利于醋酸发酵。这主要是因为醋酸菌生长及醋酸的合成均需要大量氧气的参与，过低的溶氧抑制了醋酸菌的生长并影响反应的正常进行，过高的转速虽然会增加发酵液中氧气含量，但也会导致底物乙醇的挥发耗损，同时伴随产生过高的剪切力也不利用醋酸菌的生长。

图1 转速对无花果醋发酵的影响Figure 1 Effects of rotate speed on fig vinegar fermentation

2.1.2 温度对无花果醋发酵的影响 温度影响菌体代谢合成速率及酶的活性［6］。由图2可知，在28～32℃时，醋酸菌代谢速度加快，醋酸产量随温度上升而增加，在32℃时达到最大产量，之后逐渐降低，在36℃时产量最低，可能是高温不利于醋酸菌的生长，并造成菌体内部分酶失活，影响醋酸的合成。

图2 温度对无花果醋发酵的影响Figure 2 Effects of temperature on fig vinegar ermentation

2.1.3 接种量对无花果醋发酵的影响 由图3可知，在试验范围内接种量对无花果醋发酵的影响不大，除3%接种量产量略低外，其它试验组醋酸产量均在40 g／L以上，其中以5%（m／V）接种量醋酸产量最高。分析发酵液中的酒精含量，3%（m／V）接种量酒精残留量较高，适当延长发酵周期亦能获得较高的产量，这也说明接种量对发酵周期有一定的影响，较小的接种量会延长醋酸的发酵周期。

2.1.4 发酵时间对无花果醋发酵的影响 由图4可知，发酵3 d时酒精醋化过程尚未完成，醋酸产量仅约为完全醋化时的60%左右，5～7 d时醋酸产量波动不大，发酵基本结束，继续延长发酵时间醋酸含量没有明显增加，故无花果醋的发酵时间应以5～7 d为宜。

图3 接种量对无花果醋发酵的影响Figure 3 Effects of inoculation volume on fig vinegar fermentation

图4 发酵时间对无花果醋发酵的影响Figure 4 Effects of time on fig vinegar fermentation

2.2 响应面法优化无花果醋发酵工艺

2.2.1 响应面分析方案及试验结果 根据单因素试验结果，选择可能形成曲面且对产量影响较大的3个因素（转速、温度、接种量），根据Box－Behnken试验原理以无花果醋中醋酸含量为响应值进行优化，试验因素水平编码值见表1，试验方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Variables and levels in the three－variable／threelevel response surface design

利用Design Expert软件对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到的回归方程：

表2 响应面试验结果及分析Table 2 Arrangment and results of the three－variable／three－levels central composite design

表3 回归模型各项的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

表3的方差分析显著性检验表明，该模型回归显著，并且该模型的决定系数R2＝0.985，响应值的变化有98.5%来源于所选因素，仅有1.5%的综合指标总变异不能由该模型解释，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量和响应值之间线性关系显著。失拟项P＝0.086 5＞0.05，表明方程模型失拟不显著，说明回归方程能很好的描述发酵参数与醋酸含量的关系。各变量P＜0.05时说明其对模型作用显著，由P值大小可知，在所选各因素的水平范围内对醋酸产量影响均极其显著。

图5 转速和温度交互影响醋酸产量的曲面图及等高线图Figure 5 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and temperature on vinegar production

图6 转速和接种量交互影响醋酸产量的曲面图及等高线图Figure 6 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and inoculation volume on vinegar production

2.2.2 响应面分析及优化 通过上述二次多项回归方程所作的响应曲面图及其等高线图见图5～7。通过该组动态图即可对任何两因素的交互影响醋酸产量进行评价分析，从中确定最佳因素水平范围。由图5～7可知，转速和温度对醋酸产量影响显著，表现为曲线较陡，随着二者的增减，醋酸产量变化较大，接种量对醋酸产量影响较小，曲线表现较为平缓。通过软件综合分析，得出醋酸浓度的最大估计值为52.07 g／L，与之对应的自变量实际值为转速220 r／min，温度33℃，接种量5.39%。

图7 温度和接种量交互影响醋酸产量的曲面图及等高线图Figure 7 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of temperature and inoculation volume on vinegar production

2.2.3 验证实验 以2.2.2确定的最佳条件进行3次重复验证实验，无花果醋酸平均含量达到52 g／L，与目前成品果醋的酸度（50～60 g／L）相当［13］，与理论预测值基本吻合，可见该模型能较好的预测无花果醋的发酵情况。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上用响应面分析法对无花果醋发酵工艺进行优化。得到最佳发酵条件为转速220 r／min、温度33℃、接种量5.39%，在此条件下，醋酸含量可达52 g／L。经方差分析得知转速和温度对无花果醋的发酵影响是显著的，接种量影响较不明显。另外，验证值同回归方程所得到的最大预测值非常接近，说明回归方程能较真实的反应筛选因素的影响，建立的模型与实际情况吻合度较高，因此用响应面法优化无花果醋的培养条件是有效可行的。下一步可以在发酵罐中进行优化，从而为无花果醋的产业化生产打下基础。

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