黄 瑞 余小林 胡卓炎 江杏心

HUANG Rui YU Xiao－lin HU Zuo－yan JIANG Xing－xin

杨泽嘉 纪丽纯

YANG Ze－jiaJI Li－chun

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

（College of Food Science South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China）

酸土脂环芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）属革兰氏阳性芽孢杆菌，具有嗜酸、耐热的特点。它是造成巴氏灭菌果汁（p H 2.5～5.5）腐败的主要原因之一［1］，其引起的腐败特征是产生具有特殊气味的愈创木酚、卤酚等酚类代谢物而严重影响果汁的风味和口感，有时可导致果汁的浊度升高甚至在产品底部形成白色沉淀［2］，由此给生产企业带来巨大的经济损失，并给消费者的健康安全带来隐患。2000年起，国际贸易中严格要求每10 m L浓缩果汁中其含量小于1个，美国及欧洲大部分国家从2002年起要求在浓缩果汁中不得检出酸土脂环芽孢杆菌。目前，国内外针对苹果汁、橙汁、橘汁等温带果蔬汁及混合果蔬汁中酸土脂环芽孢杆菌的研究有较多报道［3，4］，而针对荔枝汁、芒果汁、木瓜汁等亚热带果汁中酸土脂环芽孢杆菌的杀菌研究很少。荔枝是岭南特色水果，荔枝汁是除荔枝干外的最大加工产品，浓缩荔枝汁主要用于出口，对提高荔枝的经济价值有很大作用。荔枝汁的成分体系适合酸土脂环芽孢杆菌生长，该菌有存在于荔枝汁中的可能性。然而，传统的巴氏杀菌方法不仅有可能使酸土脂环芽孢杆菌残存，而且还会使荔枝汁等亚热带果汁加热后的风味、颜色等品质变劣，况且酸土脂环芽孢杆菌能够耐受高温，瞬时高温灭菌过程不能致死［5］，这使亚热带果汁的生产有可能面临新的问题，与苹果汁等其它果汁一样，成为中国果汁拓展国内外市场的风险因素之一。

超声杀菌作为一种冷杀菌方式，近年在果蔬加工中的应用研究有较多报道［6－8］。超声具有的空化作用能够在极短的时间内杀灭和破坏微生物，该作用在液体中产生的局部瞬间高温及温度交替变化、局部瞬间高压和压力变化，使液体中某些细菌致死、病毒失活，甚至使体积较小的某些微生物的细胞壁破坏［7］；由于超声处理不需要加热，因而可保持果汁等食品原有滋味和风味［8］。然而超声波对酸土脂环芽孢杆菌的杀菌效果目前尚未见报道，因此本研究以荔枝汁为原料，人为将酸土脂环芽孢杆菌添加于荔枝汁中，探讨在荔枝汁的物质成分体系下，不同超声处理对酸土脂环芽孢杆菌的杀灭效果，同时比较超声杀菌和水浴加热杀菌对荔枝汁品质的影响。旨在为超声技术在果蔬汁中的应用提供依据，同时进一步深入对酸土脂环芽孢杆菌的研究。

1 材料及方法

1.1 材料及处理

荔枝汁的制备：品种为怀枝，市售。将新鲜荔枝清洗干净后去皮、去核、榨汁、过滤；取过滤后荔枝汁50 m L，加入菌液浓度为105～106CFU／m L的酸土脂环芽孢杆菌菌悬液，然后进行超声杀菌处理；

酸土脂环芽孢杆菌：取自广东省微生物菌种保藏中心，将其接种于BAM培养基、活化后于4℃保存；

BAM培养基：按美国模式培养物集存库（American type culture collection）标准配置。

1.2 试验仪器

超声波细胞破碎机：SCIENTZ－ⅡD型，宁波新芝生物科技有限公司；

超净工作台：SW－CJ－1FD型，苏州安泰空气技术有限公司；

温度梯度恒温箱：MTI－201B型，日本Eyela公司；

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅：SYQ－DSX－280B型，上海申安医疗器械厂；

生物显微镜：XSP－16A型，江南光学仪器厂；

双层恒温振荡器：ZWY－A2102C型，上海智城分析仪器制造有限公司；

色差计：CM－3500d型，日本美能达公司；

电热恒温水浴锅：DK－SD型，上海一恒科技有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 超声杀菌试验设计

（1）单因素试验：超声功率的单因素试验分别取0，100，200，300，400，500，600 W，固定超声时间为5 min、超声间歇时间为5 s；超声时间的单因素试验分别取0，1，3，5，7，9，11，13，15 min，固定超声功率为400 W、超声间歇时间为5 s；超声间歇时间的单因素试验分别取1，3，5，7，9 s，固定超声功率为400 W、超声时间为5 min；果汁p H的单因素试验分别用柠檬酸将果汁p H 调节为3.5，3.7，3.9，4.1，4.3以及未调节原液，固定超声时间5 min、超声功率400 W、超声间隔时间5 s。以各单因素条件处理荔枝汁，考察不同超声处理因素对荔枝汁中酸土脂环芽孢杆菌杀菌效果的影响。

（2）响应面试验：在单因素试验的基础上，采用Design Expert 8.05试验设计软件，利用响应面方法（RSM）中Box－Behnken设计（BBD），进行超声处理的条件优化。

1.3.2 水浴加热杀菌 取按1.1制备的荔枝汁50 m L置于灭菌后玻璃瓶中，在90℃水浴中加热灭菌10 min。

1.4 分析方法

1.4.1 酸土脂环芽孢杆菌数目测定 将各处理前后的荔枝汁1 m L稀释梯度后，涂布于BAM琼脂平板培养基，在50℃恒温培养48 h、计数；根据处理前后的酸土脂环芽孢杆菌数目，按式（1）计算酸土脂环芽孢杆菌杀菌率。

式中：

W——酸土脂环芽孢杆菌杀菌率，%；

C——超声处理后的酸土脂环芽孢杆菌数，CFU／m L；

C0——超声处理前的酸土脂环芽孢杆菌数，CFU／m L。

1.4.2 果汁品质指标的测定 Vc按照 GB 6195－1986（2，6－二氯靛酚滴定法）进行测定；总酸按照GB／T 12456－2008（酸碱滴定法）进行测定；总糖和还原糖按照参考文献［9］的方法测定；色差值的测定取各处理荔枝汁10 m L于专用的测色皿中，用色差仪测定△E，L，a，b。

1.4.3 数据处理与分析 以上各指标测定均为3平行，分别取其平均值，并采用 Excel 2010 和 SPSS（statistical product and service solutions）对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验的结果

超声处理单因素条件对荔枝汁酸土脂环芽孢杆菌的杀菌效果见图1。由图1（a）可知，随着超声功率的升高，杀菌率先上升后略有下降，在400 W处达到最大值为89.17%，在600 W处为79.83%。这是因为一定范围内增加超声功率，可促进空化作用，并使空化导致的一定热效应、空化机械作用增强，从而增强杀菌效果；而超过该范围时，功率过大反而使空化泡不易产生，故表现为杀菌效果不随之增加，周丽珍等［10］对超声杀菌研究也有类似结果，因此，其余单因素试验均采用400 W的超声功率。

由图1（b）可知，随着超声时间的增加，杀菌率呈上升趋势，超声时间为9 min时杀菌率为91.62%，15 min时杀菌率为96.78%，两者之间的杀菌率差异为5.16%。虽然超声作用时间对微生物致死有一定差异，但超声15 min的杀菌率仅比9 min提高了5.63%，考虑到长时间超声处理会使果汁升温，对果汁中热敏性成分产生影响，对机器的损耗也较大，故选取超声处理时间为9 min进行其余试验。

超声间隔时间反映的是超声连续工作的时间，由图1（c）可知，改变超声间隔时间，对杀菌率的影响表现为先略有上升后略有下降的趋势，变化范围在75.07%～85.07%；在间隔时间5 s处出现转折点，此时的杀菌率达到最小值为85.07%。

由图1（d）可知，未调节p H的原液经超声处理后的杀菌率为87.07%，除p H 3.7条件下杀菌率比未调节小外，其余各p H调节条件下的杀菌率均比原液大。

图1 不同超声条件对荔枝汁酸土脂环芽孢杆菌的杀菌效果Figure 1 Sterilizing effect of different ultrasound conditions on Alicyclobacillus acidoterrestris in Litchi Juice

利用SPSS软件分别对超声条件进行AVOAN分析，结果为：超声时间对杀菌效果影响极显著（P＜0.01），超声功率和超声间隔时间对杀菌效果影响显著（P＜0.05），果汁p H对杀菌效果影响不显著。

2.2 超声处理响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立及显著性检验 根据单因素试验结果，以超声功率、超声间歇时间、超声时间为自变量，以杀菌率为响应值，进行响应面试验。因素水平设计见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

根据表2结果，利用Design Expert 8.05软件对所得数据进行回归分析，得到多元二次回归模型：

表1 Box－Behnken试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of Box－Benhnken lest

由表3可知，一次项X2影响极其显著，X1、X3影响显著，表明超声时间、超声功率、超声间隔时间均对杀菌率的线性效应显著；二次项X1影响极其显著，X2影响高度显著，X3影响显著，交互项X2X3影响显著。回归方程的相关系数R2＝0.987 1，P值为0.000 3，回归方程模型达到显著水平，且失拟项不显著，说明该模型与实际情况拟合度良好。同时，由F值大小可以判断，在所选择的因素范围内，各因素对结果的影响排序为超声时间＞超声功率＞超声间隔时间。

表2 Box－Behnken设计试验结果Table 2 Box－Behnken experimental design arrangement and responses

2.2.2 响应曲面分析 由图2可知，随着超声功率、超声时间、超声间隔时间的增加，杀菌率逐渐上升；但继续增加超声功率、超声时间、超声间隔时间，杀菌率开始下降。综合分析可知，超声功率与超声时间、超声时间与超声间隔时间交互作用显著，超声功率与超声间隔时间交互作用不显著，且在超声功率360～410 W、超声时间6.8～8.3 min、超声间隔时间4.5～5.3 s范围内具有最大响应值。

表3 回归与方差分析结果Table 3 Results of regression and variance analysis

表3 回归与方差分析结果Table 3 Results of regression and variance analysis

＊＊＊差异极其显著，P＜0.001；＊＊差异高度显著，P＜0.01；＊差异显著，P＜0.05。R 2＝0.987 1，R＝0.963 7，信噪比＝17.535。

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性模型 389.15 9 43.24 42.36 0.000 3 ＊＊＊X1 12.78 1 12.78 12.52 0.016 6 ＊X2 168.91 1 168.91 165.46＜0.000 1 ＊＊＊X3 12.43 1 12.43 12.17 0.017 5 ＊X1 X2 3.69 1 3.69 3.61 0.115 8 X1 X3 0.016 1 0.016 0.015 0.906 4 X2 X3 7.78 1 7.78 7.63 0.039 8 ＊X 12 149.69 1 149.69 146.63＜0.000 1 ＊＊＊X 22 37.80 1 37.80 37.03 0.001 7 ＊＊X32 14.95 1 14.95 14.64 0.012 3 ＊残差项 5.10 5 1.02失拟项 3.92 3 1.31 2.20 0.327 8纯误差 1.19 2 0.59总误差 394.26 14

2.2.3 最优条件的确定及验证实验 根据Design Expert 8.05软件分析，得出超声杀灭荔枝汁中酸土脂环芽孢杆菌的最佳处理条件为：超声功率385 W、超声时间7.69 min、超声间隔时间4.89 s，在此条件下模型预测的最大杀菌率为92.16%。考虑到实际操作情况，将此最佳杀菌条件修正为超声功率400 W、超声时间7.5 min、超声间隔时间5 s，进行验证实验，共3次，测得该条件下酸土脂环芽孢杆菌的杀菌率的平均值为92.25%，与模型预测值的误差为0.466%，表明模型与实测的吻合度良好，说明采用响应面法优化得到的条件参数准确可靠，得到的回归方程具有一定的实际意义。

2.3 超声处理对荔枝汁品质的影响

为考察超声处理对荔枝汁营养成分的影响，选取同一批荔枝汁，按上述杀菌方法，测定了在优化条件处理前后荔枝汁的Vc、总酸、总糖、还原糖以及色差值，并与90℃水浴加热杀菌进行比较，结果见表4。由表4可知，加热杀菌的杀菌率为90.66%，超声杀菌的杀菌率为92.25%，即超声杀菌效果优于加热杀菌。超声波杀菌后荔枝汁Vc、总酸、总糖、还原糖的降低程度均小于加热杀菌，色差值△E，b的变化也小于加热杀菌，视觉上可观察到加热杀菌后荔枝汁色泽变暗程度远远大于超声杀菌。超声杀菌主要是利用超声波的空化作用，对热敏强的Vc损失较小，而加热杀菌由于温度升高促进了Vc的分解。结果表明超声杀菌能有效地保持荔枝汁的营养品质和果汁原有色泽。

图2 不同因素两两交互作用对杀菌效果影响的响应曲面分析Figure 2 Response surface analysis of significant effective interacti on items of ultrasonic power，ultrasonic treatment time and ultrasonic intermittent time on sterilization

表4 不同杀菌方式处理的荔枝汁各品质指标Table 4 Different sterilization methods on quality indicators in litchi juice

3 结论

（1）通过响应曲面分析得到超声杀灭荔枝汁中酸土脂环芽孢杆菌的最佳处理条件为：超声功率400W、超声间隔时间5 s、超声时间7.5 min；在该条件下，酸土脂环芽孢杆菌的杀菌率为92.25%。

（2）超声杀菌对荔枝汁Vc、糖酸以及色泽的影响程度小于加热杀菌。

（3）在最佳超声条件下，酸土脂环芽孢杆菌杀菌率92.25%仍无法达到果汁国际贸易的要求（＜1个／10 m L），需要进一步研究超声与其他杀菌方式的联用。

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