廖明娟 蔺万煌 曹 庸

LIAO Ming－juan 1 LIN Wan－huang 1 CAO Yong 2

欧阳文3 周双德1 李昌珠1

OUYANG Wen 3 ZHOU Shuang－de 1 LI Chang－zhu 1

（1.湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；4.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

（1.Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China；3.Pharmaceutical College of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；4.Hunan Academy of Forestry，Changsha，Hunan 410004，China）

蓖麻（Ricinus communis L.）是世界十大油料作物之一，去油后粕中除含有丰富的蛋白质、氨基酸及微量元素等多种营养物质外，还含有0.23%的蓖麻碱［1］。蓖麻碱是一种小分子生物碱，具有较强的毒性［2］。研究［3］表明，人体摄入蓖麻碱后可造成恶心、呕吐、出血性胃肠炎、肝脏和肾功能损害、抽搐、昏迷、低血压、呼吸抑制甚至死亡。当饲料中蓖麻碱含量超过0.01%时可抑制鸡的生长，含量超过0.1%时可使鸡麻痹致死［3］。

目前，国内外主要使用物理、化学、微生物法和联合法来对蓖麻粕粕脱毒［4－7］。虽已取得了一定的成效，但同时也存在各方面的弊端和不足，物理脱毒法工艺一般比较复杂，耗能较大；化学脱毒工艺较简单，但是需添加化学物质，营养成分受损；微生物发酵法脱毒时间过长，且不能保证其营养成分不流失。因此各种脱毒方法很难在实际生产中进行工业化生产，故开发蓖麻脱毒的新工艺成为该领域研究的热点。

本研究拟采用一种新型的具有自主产权的连续相变萃取装置［8］去除蓖麻粕中的蓖麻碱，利用该装置具有密闭、高效低温和低压的特点，探讨一种简单高效、省时、耗能低和营养成分不流失的新型脱毒工艺。通过考察温度、时间和萃取压力对蓖麻碱去除率的影响，对蓖麻碱去除工艺条件进行优化，为蓖麻粕用作蛋白饲料提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓖麻粕：油含量低于3%，湖南省金汇有限公司；

电子天平：AL104型，梅特勒—托利多国际贸易（上海）有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG－9070型，上海一恒科学仪仪器有限公司；

连续相变萃取：珠海共同机械有限公司；

冷冻干燥机：FD－1DF型，北京德天佑科技发展有限公司；

高效液相色谱仪：LC－10A型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蓖麻碱的提取及结构鉴定 蓖麻粕按1∶10（m∶V）的比例加入甲醇，超声（超声频率为40 k Hz，超声功率为250 W）提取0.5 h，重复2次，将粗提物浓缩冻干后，采用中压柱层析色谱法以及高效制备液相色谱法进行分离，得到蓖麻碱。首先采用高效液相色谱分析单体化合物的纯度，然后采用核磁共振仪测定化合物的磁共振谱（1H－NMR、13CNMR），鉴定单体化学结构。

1.2.2 蓖麻碱高效液相色谱（HPLC）分析条件 反相色谱柱C18（250 mm×4.6 mm，25μm）；流动相：乙腈—水（1∶9），流速：1 m L／min；检测波长：308 nm；进样量：10 L［9］。

1.2.3 标准曲线的绘制 准确配制1 mg／m L蓖麻碱标准溶液，然 后 将 其 分 别 配 制 成 浓 度 为 0.8，0.6，0.4，0.2，0 mg／m L的标样进行HPLC检测，制作标准曲线。

1.2.4 响应面优化连续相变萃取去除蓖麻碱的试验设计

在单因素试验基础上，根据Box－Behnken中心组合设计原理，选取脱毒温度、时间和萃取压力为考察因素，试验因素水平见表1，以蓖麻碱去除率为响应值，进行中心组合试验设计。采用Design－expert 7.0对所得数据进行分析处理。

1.2.5 营养成分的测定

（1）粗蛋白测定：根据GB／T 6432—1994进行；

（2）粗纤维测定：根据GB／T 6434—2006进行；

（3）粗脂肪测定：根据GB／T 6433—2006进行；

（4）粗灰分测定：根据GB／T 6438—2007进行；

（5）钙测定：根据GB／T 6436—2002进行；

（6）磷测定：根据GB／T 6437—2002进行。

表1 Box－Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and their level of Box－behnken experimental design

2 结果与讨论

2.1 蓖麻碱结构鉴定

由于目前市场上尚无法购得蓖麻碱标准品，本试验参考张海悦等的方法［10］以确定蓖麻碱。然后再对该物质进行核磁共振分析，氢谱和碳谱结果为1H－NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.073（1H，d，J＝7.5 Hz，5－H），7.535（1H，d，J＝7.5 Hz，6－H），4.011（3H，s，OCH3），3.564（3H，s，NCH3）。13C－NMR（150 MHz，CDCl3）δ：161.286（C－2），88.717（C－3），172.363（C－4），93.363（C－5），143.444（C－6），57.111（－ OCH3），37.551（－NCH3），113.614（－CN）。分析可得其化学式为3－氰基－4－甲氧基－1－甲基－2－吡啶酮，分子式为C8H8N2O2，确定该物质为蓖麻碱。此结果与张海悦等［10］的报道相吻合。

2.2 蓖麻碱含量标准曲线的绘制

利用本试验提取得到的蓖麻碱作为标准品，采用HPLC检测蓖麻碱含量，见图1。以蓖麻碱含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y＝7 005.2x＋475 401（R2＝0.996 7）。

图1 蓖麻碱的HPLC图谱Figure 1 HPLC diagram of ricinine

2.3 响应面分析

根据Box－Behnken中心组合设计原理，选用温度、时间和萃取压力3个影响因素，以蓖麻碱去除率为响应值（R），响应面试验设计及结果见表2。

利用Design－Expert对试验数据进行分析，得到温度、时间、萃取压力3个因素的三元二次回归模型：

对此回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，该模型达到显著性差异（P＝0.020 5），失拟项不显著（P＝0.071 2）。R2＝0.826 2，说明该模型能解释82.62%的响应值的变化，各因素值和响应值之间的关系可以用该模型函数化，并不需要引入更高次数的项，可以用该模型代替试验点对试验结果进行分析和预测。其中，B和A2为显著性因素，即温度、时间和萃取压力3个影响因素中，时间对蓖麻碱去除率的影响力最为显著（P＝0.004 4）。

2.4 响应曲面及等高曲线分析

表2 Box－Benhnken试验设计及结果Table 2 Box－Benhnken experimental design arrangement and experimental results

表3 回归模型方差分析表Table 3 ANOVA for the regression model

为了使各因素及其相互作用能有效直观的反映，采用Design－expert分析软件绘制响应面曲线及等高值线，见图2～4。由图2可知，当时间不变时，蓖麻碱的去除率随温度升高而增大，到达最高点后又随之减小；当温度不变时，蓖麻碱的去除率随时间的延长呈现先增大后下降的趋势。由图3可知，当保持温度不变时，蓖麻碱去除率随着萃取压力的升高先降低；当萃取压力一定时，蓖麻碱去除率随温度的升高呈现先升高后降低的趋势。由图4可知，当时间保持一定时，蓖麻碱去除率随着萃取压力的升高而呈现逐渐升高的趋势；在萃取压力一定时，蓖麻碱去除率随着时间的升高呈现先上升后降低的趋势。

2.5 最优蓖麻碱去除条件的确定及验证实验

为了检验预测的优化培养条件，按照模型给出的优化条件：温度、时间、泵压相对应的编码值分别为0.34，0.47，－1，将其转化为实际参数值，得出温度为76.8℃，时间为2.25 h，萃取压力为0.1 MPa，此时蓖麻碱去除率的模型理论预测值为92.01%。采用以上所得最佳脱毒条件进行验证实验，经3次平行实验测得蓖麻碱去除率为91.75%与预测值相比，相对误差为0.002 6，表明预测值和实际值有很好的拟合性，证明该响应面分析方法优化得到的工艺参数准确可靠，具有较高的应用价值。

图2 温度和时间对蓖麻碱去除率影响的曲面和等高线Figure 2 Curved surfaces and contours affected by temperature and time on the removal of ricinine

图3 温度和萃取压力对蓖麻碱去除率影响的曲面和等高线Figure 3 Curved surfaces and contours affected by temperature and extracting pressure on the removal of ricinine

2.6 脱毒前后蓖麻粕中各营养成分的测定

由表4可知，除粗脂肪外，脱毒前后其余各营养成分并无明显变化，这是由于脂肪类物质可能在甲醇萃取过程中被带至解析斧中，使粗蛋白含量相对有所增加，其他营养成分变化差异并不明显。粗脂肪的去除，可以防止蓖麻粕蛋白的氧化酸败，有利于长期保存。整体来说，该脱毒方法对蛋白和矿物质元素等营养成分变化并不明显。脱毒后蓖麻粕的蛋白质含量为39.30%。

3 结论

表4 脱毒前后各成分含量的变化Table 4 Content of each componential before and after detoxification ／%

蓖麻饼粕中含有约0.36%的蓖麻碱，在作为饲料之前必须进行脱毒处理。本研究主要应用新型的脱毒工艺——连续相变萃取法脱毒，在单因素的基础上，重点对脱毒时间、温度和萃取压力及其相互作用进行探讨，经响应面优化法获得蓖麻碱脱毒的最佳条件为脱毒温度76.8℃，时间2.25 h，萃取压力0.1 MPa。在该条件下蓖麻碱去除率为91.75%，此时蓖麻碱含量约为0.03%。在此条件下经脱毒后的蓖麻粕无需过多的后续处理即可直接添加到饲料中，添加量可达30%。脱毒后的蓖麻粕跟脱毒前的蓖麻粕除粗脂肪外其余营养成分并没有太大变化，在保证了粗蛋白等主要养分不流失的情况下，达到了很好的脱毒效果，为蓖麻粕作为动物蛋白饲料奠定了基础，同时也为缓解蛋白饲料供需偏紧的局面［11，12］和大豆的大量进口［13，14］带来福音。

图4 萃取压力和时间对蓖麻碱去除率影响的曲面和等高线Figure 4 Curved surfaces and contours affected by extracting pressure and time on the removal of ricinine

应用连续相变萃取蓖麻碱脱毒条件，具有以下优势：① 对比现有脱毒工艺［1，4，6］，该工艺仅以甲醇为萃取剂，且脱毒后蓖麻粕中甲醇残留量少，只需在60℃烘箱进行挥发即可直接添加到饲料中，无需水洗等过程。② 萃取剂可反复回收利用，与常规方法相比，该工艺流程简单、可操作性强，生产成本低，溶剂消耗和能耗低，脱毒效率高，营养成分不流失，污染小，重复性好，可实现大规模工业化连续性生产。③ 整个脱毒过程在密闭条件下进行，因此在保证高去除率的情况下，还能保证营养成分的不流失。④ 中国蓖麻粕资源丰富，此研究可有效提高蓖麻粕的综合利用效率，同时也解决了蛋白饲料紧缺的一大问题。

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