王 申 周 佳 徐 晶 尹帅星 吴永宁 宫智勇

WANG Shen 1 ZHOU Jia 1 XU Jing 1 YIN Shuai－xing 1 WU Yong－nin 2 GONG Zhi－yong 1

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.国家食品安全风险评估中心，北京 100021）

（1.College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023，China；2.China National Center for Food Safety Risk Assessment，Beijing 100021，China）

目前市场上销售的大米蛋白主要是大米淀粉生产的副产物，也可从米糠和碎米中直接提取。在谷物蛋白质中，大米蛋白的价值主要体现在它的低过敏性、无色素干扰、柔和的味道及高营养价值上［1，2］。近年来，从动植物蛋白质中获取生物活性肽成为食品科学研究领域的一个热点。来源于食物蛋白的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽对高血压患者有降压作用［3］，但血压正常者服用则无降压作用，安全性高且无副作用，特别适于作为口服药剂或功能性食品中的有效成分［4，5］。目前，乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、牛血浆、玉米胚芽中都分离出了ACE抑制肽［6］。

已有很多研究［7－9］表明，大米多肽具有良好的ACE抑制活性。现在制备大米生物活性肽的常用方法是酶法［9，10］，但这种方法存在酶解效率低，产物活性不高的问题［11］。胡子豪等［12］探讨如何提高食源性ACE抑制肽活性的方法中，提到可在提取过程中改进试验路线以达到目的。超声波预处理可促使蛋白质亲水基团更多地暴露出来，提高其在水中的溶解度，有利于酶和蛋白质底物结合，最终提高酶解效率［13］。同时有研究［14］表明，微波可辅助蛋白质及其衍生物一级结构进行水解，微波加热可在短时间内达到很高的温度，减少对蛋白质本身的伤害，并且微波能通过改变蛋白质的构象影响它的生物活性。超声—微波处理已被应用于提高米饭品质［15］和优化豆粕中总黄酮提取［16］等的研究中。而大米蛋白预处理研究中，贾俊强等［17］采用超声波预处理大米蛋白制备抗氧化肽，马海乐等［11］采用超声波处理大米蛋白制备大米降血压多肽，还未有采用超声、微波联合预处理大米蛋白的研究。本研究采用超声处理、微波加热的方法对大米蛋白进行联合预处理，以提高酶解大米蛋白制备ACE抑制肽的效率，为大米资源的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米蛋白：蛋白质含量81.37%，江西恒天实业有限公司；

碱性蛋白酶：2.4 U／g，丹麦 Novo Nordisk公司；

血管紧张素转化酶（ACE）、马尿酰—组氨酰—亮氨酸（HHL）、马尿酸（Hip）：美国Sigma公司；

乙腈、三氟乙酸：色谱纯，中国医药集团总公司；

盐酸、氢氧化钠：分析纯，中国医药集团总公司；

p H校正缓冲液：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，美国Agilent公司；

酸度计：320－S型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

电子天平：FA2104型，上海民侨精密仪器有限公司；

冷冻干燥机：LG－3型，宁波市生化仪器厂；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF－101S型，予华仪器有限责任公司；

离心机：TGL－205型，长沙平凡仪器仪表有限公司；

微波、紫外、超声波三位一体合成萃取反应仪：UWave－1000型，上海新仪微波化学科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

粉碎大米蛋白→加双蒸水混匀→超声、微波预处理→酶解→离心（4 000 r／min，10 min）→上清液→调p H 值至7→真空冷冻干燥→大米多肽粗品→检测对ACE的抑制率

1.3.2 单因素试验设计

分别考察超声功率、超声处理时间、微波处理温度、搅拌速度对大米多肽ACE抑制率的影响。

（1）超声波功率的影响：在超声时间35 min、微波加热温度45℃、搅拌速度900 r／min下，将样品分别在超声波功率150，350，550，750 W 下进行预处理之后酶解，考察ACE抑制活性。

（2）预处理时间的影响：在超声功率150 W、微波加热温度45℃、搅拌速度900 r／min下，将样品分别预处理15，25，35，45 min之后进行酶解，考察ACE抑制活性。

（3）微波加热温度的影响：在超声功率150 W、作用时间35 min、搅拌速度900 r／min下，将样品分别在微波加热温度35，45，55，65℃下进行预处理之后酶解，考察 ACE抑制活性。

（4）搅拌速度的影响：在超声功率150 W、微波加热温度45℃、作用时间35 min下，将样品分别按250，750，1 250，1 750 r／min的搅拌速度进行预处理之后酶解，考察ACE抑制活性。

1.3.3 超声、微波预处理正交试验设计 根据单因素试验研究结果，对超声预处理条件进行正交优化。经过超声微波预处理后，对大米蛋白进行酶解反应。酶解参数：底物质量浓度7.5%（m／V），碱性蛋白酶与底物蛋白质量比2%，温度55℃，p H 9.0，酶 解 时 间 120 min［18］。 以 酶 解 产 物 对ACE的抑制率评价其降血压活性。

1.3.4 血管紧张素转化酶抑制活性的测定 参照文献［19］。

1.3.5 半抑制浓度（IC50）的测定 称取大米肽样品，配成不同质量浓度梯度的大米多肽粗品溶液，分别测定其对ACE的抑制率。以不同稀释浓度的大米肽ACE抑制率与大米肽浓度做曲线，通过拟合的曲线方程，计算当ACE抑制率为50%时，所对应大米肽的浓度值，即IC。

2 结果与讨论

2.1 超声波预处理单因素试验

2.1.1 超声波功率的影响 由图1可知，超声波功率在150～550 W范围内随着功率的升高，酶解产物ACE抑制率逐步提高，在550 W时抑制率达到最高；当超声波功率大于550 W时，酶解产物ACE抑制率开始下降。说明在一定范围内增加超声波功率可改变蛋白质构象，促使其亲水基团更多地暴露出来，提高蛋白质在水中的溶解度，有利于酶和蛋白质底物结合，从而提高酶解产物ACE抑制率［11］，但过高会破坏蛋白质的空间结构，从而降低酶解产物ACE抑制率，所以提取超声波功率在400，500，600 W较为适宜。

图1 超声波功率对酶解产物ACE抑制率的影响Figure 1 Influence of ultrasonic power on ACE inhibitory activity of hydrolysate

图2 预处理时间对酶解产物ACE抑制率的影响Figure 2 Influence of action time on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.1.2 预处理时间的影响 由图2可知，随着作用时间的增加，酶解产物ACE抑制率逐步增加，在25 min时ACE抑制率最高，之后抑制率逐渐降低。这个过程可能是大米蛋白随着预处理时间的延长，大米蛋白的溶解度提高，一定时间后蛋白质的溶解达到饱和，若再进一步延长预处理时间，可能破坏蛋白质的空间结构，造成酶解产物ACE抑制率降低。所以选取20，25，30 min为正交试验的水平因素。

2.1.3 微波加热温度的影响 由图3可知，随着微波加热温度的提高，ACE抑制率先上升后下降，但ACE抑制率增幅较慢，同时ACE抑制率相差不大，考虑到接下来的酶解试验的温度为55℃，选取45，50，55℃的数据进行正交试验。

图3 微波加热温度对酶解产物ACE抑制率的影响Figure 3 Influence of heating temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.1.4 搅拌速度的影响 由图4可知，随着搅拌速度的升高，酶解产物 ACE抑制率也逐步升高，在达到700 r／min时，抑制率最高，当搅拌速度超过700 r／min时，抑制率下降，可能搅拌速度过高导致机械力化学效应过高引起蛋白质结构发生改变［22］，因此最适搅拌速度为700 r／min左右。所以选取500，700，900 r／min作为正交试验的因素水平。

图4 搅拌速度对酶解产物ACE抑制率的影响Figure 4 Influence of stirring rate on ACE inhibitory activity of hydrolysate

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验研究结果，对超声预处理条件进行正交优化。选取超声功率、超声处理时间、超声处理温度（超声处理时保持恒温）、搅拌速度做4因素3水平正交分析试验，4因素3水平编码表见表1。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experiment design

由表2可知，影响酶解产物ACE抑制活性主次顺序为A＞D＞B＞C。综合上述试验结果与分析，大米蛋白预处理的最佳工艺条件为A2D1B1C3，即超声波功率为500 W、搅拌速度为500 r／min、作用时间为20 min、微波加热温度为55℃，此时酶解后酶解产物ACE活性最高。在此条件下，进行验证实验，测得ACE抑制率为90.70%。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 L9（34）Orthogonal experiment result

2.3 最优条件下大米多肽的IC50

图5 不同质量浓度大米肽对ACE抑制活性Figure 5 ACE inhibitory activity of rice peptide at different concentrations

由图5可知，随着大米肽质量浓度的升高，其对ACE的抑制率也逐步升高。当大米肽质量浓度为1.6 mg／m L时，ACE的抑制率最高，为85.87%。通过计算可得大米肽对ACE抑制的IC50为0.226 mg／m L。结果表明，本次研究得到的大米肽具有很强的ACE抑制活性，比马海乐等［11］研究得到的大米降血压肽（IC50＝1.71 mg／m L）和从玉米湿磨副产品中分离出的 ACE抑制肽［5］（IC50＝1.02 mg／m L）要高。这可能与超声、微波联合预处理大米蛋白，改善了大米蛋白本身的溶解度和构象有关。

3 结论

本研究通过单因素试验并在此基础上进行了4因素3水平正交分析试验，得到最佳工艺条件为超声波功率500 W、搅拌速度500 r／min、作用时间20 min、微波加热温度55℃，在最优条件下，ACE抑制率为90.70%。经过超声、微波联合预处理大米蛋白，大米肽粗品的ACE抑制率可从65.44%提高到90.7%，此时大米肽粗品的IC50为0.226 mg／m L。因此，超声、微波联合预处理大米蛋白制备ACE抑制肽取得了较好的效果，这种方法具有广阔的发展前景。

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