李加兴 房惠芳 陈选 吴越 涂媛 周炎辉

LI Jia－xing 1 FANG Hui－fang 1 CHEN Xuan 2 WU Yue 2 TU Yuan 2 ZHOU Yan－hui 2

（1.吉首大学食品科学研究所，湖南 吉首 416000；2.湖南奇异生物科技有限公司，湖南 长沙 410008）

（1.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China；2.Hunan Amazing Grace Biotechnology Co.，Ltd.，Changsha，Hunan 410008，China）

牡丹在药用区域的研究开发一直受到重视，其药用的主要部位是根皮即丹皮，具有清热凉血、活血散瘀的功效［1，2］。牡丹籽是生产牡丹皮的副产物，含油量为23.76%～27.06%［3］。研究［4］表明，牡丹籽油不饱和脂肪酸含量高达90%以上，具有降血脂、降血糖等作用［5］，近年来发展成为又一种极具开发利用前景的高级木本食用油。而提取牡丹籽油后的牡丹籽粕中的粗蛋白含量高达26.98%［6］，可作为提取植物蛋白的资源加以综合利用。

国内外提取蛋白有很多方法，主要有碱提法、盐提法、水提法等［7－9］。碱提酸沉法目前仍是提取蛋白的常用方法，因其不会生成有害物质，对环境污染相对较小，并且适用于工业化生产，因而被广泛运用于天然植物蛋白的提取，如花生蛋白、玉米谷蛋白、油茶籽蛋白、大米蛋白、麦麸蛋白等［10－16］，但尚未见此法应用于提取牡丹籽粕蛋白的相关报道。因此，本试验拟对碱提酸沉法提取牡丹籽粕蛋白的工艺条件进行研究，并测定其蛋白质等电点，为牡丹籽粕的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牡丹籽粕：以湘西永顺牡丹栽培基地的牡丹籽为原料，经超临界CO2萃取提油后所剩余的部分，经检测其蛋白质含量为25.91%（以微量凯氏定氮法测定［17］）；

石油醚（60～90℃）：分析纯，天津市天力试剂化学有限公司；

牛血清蛋白、硼酸、甲基红、溴甲酚绿：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

考马斯亮蓝G－250：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

定氮仪：KDN－2C型，上海纤检仪器有限公司；

消化炉：HYP－Ⅱ型，上海纤检仪器有限公司；

微型植物粉碎机：FZ102型，天津市泰斯特仪器有限公司；飞鸽牌离心机：LXJ－IIB型，上海安亭科学仪器厂；

实验室p H计：雷磁PHS－J4A型，上海精密科学仪器有限公司；

可见分光光度计：723型，上海菁华科技有限公司；

恒温水浴锅：二列四孔 HH.S21－Ni4型，上海寰熙医疗器械有限公司；

电热鼓风干燥箱：101－2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；

高精度电子天平：JA－5103N型，上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

牡丹籽粕→粉碎→干燥→过筛→脱脂→调节p H→恒温浸提→离心分离→上清液加酸沉淀→静置→离心沉淀→沉淀调p H至中性→冷冻干燥→牡丹蛋白

1.3.2 操作要点 将牡丹籽粕粉碎后干燥，过60目筛，以石油醚为溶剂，采用索氏抽提法去除牡丹籽粕中残留的油脂，之后低温烘干，备用。精确称取5.0 g脱脂牡丹籽粕置于烧杯中，按一定料液比加入蒸馏水，并加碱液调p H，在设定的提取温度和提取时间下提取蛋白，之后于3 000 r／min下离心20 min，收集上清液，上清液加1 mol／L稀盐酸调p H至等电点，静置2～3 h后离心收集沉淀，沉淀调p H至中性，冷冻干燥后即得粗蛋白。

1.3.3 牡丹籽粕蛋白等电点测定 称取10 g样品，按料液比1∶15（m∶V）加水，并用氢氧化钠溶液调p H 至10.0，45℃恒温浸提80 min，离心（3 000 r／min、20 min）取上清液，取1 m L上清液稀释100倍后再取1 m L测吸光值，依据标准曲线计算出蛋白质含量；再分取6份上清液各14 mL，加盐酸调p H 值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，3 000 r／min离 心20 min，上清液稀释100倍，分别取1 m L测吸光值，依据标准曲线计算出蛋白质含量。按式（1）计算蛋白质沉淀率，沉淀量最大时的p H即为蛋白质等电点［18］。

式中：

R——蛋白质沉淀率，%；

m1——酸沉前上清液蛋白质含量，mg／m L；

m2——酸沉后上清液蛋白质含量，mg／m L。

1.3.4 单因素试验设计

（1）料液比对牡丹籽粕蛋白提取率的影响：设定提取温度45℃、提取时间60 min、p H 10，分别控制料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（m∶V）提取牡丹籽蛋白，探讨料液比对牡丹籽粕蛋白提取率的影响。

（2）提取时间对牡丹籽粕蛋白提取率的影响：设定提取温度45℃、料液比1∶15（m∶V）、p H 10，分别控制提取时间为40，60，80，100，120 min，探讨提取时间对牡丹籽粕蛋白提取率的影响。

（3）提取温度对牡丹籽粕蛋白提取率的影响：设定提取时间80 min、p H 10、料液比1∶15（m∶V），分别控制提取温度为25，35，45，55，65℃，然后计算蛋白质提取率，探讨提取温度对牡丹籽粕蛋白提取率的影响。

（4）p H对牡丹籽粕蛋白提取率的影响：设定浸提温度45℃、浸提时间80 min、料液比1∶15（m∶V），分别用氢氧化钠溶液调节p H至7，8，9，10，11，探讨p H 对牡丹籽粕蛋白提取率的影响。

1.3.5 正交试验 在单因素试验的基础上，对料液比、提取时间、提取温度和p H采用正交试验进行优化，以确定提取牡丹籽粕蛋白的最佳工艺条件。

1.3.6 牡丹籽粕中蛋白质含量的测定 微量凯氏定氮法［17］。

1.3.7 上清液中的蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法［19，20］。

（1）标准曲线的制作：在一定浓度的乙醇及酸性条件下，考马斯亮蓝G－250可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，并在465～595 nm处有最大的光吸收值，因此可以通过检测595 nm下的吸光度来计算蛋白质的含量。准备6支具塞试管，分别取浓度为0，0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mg／m L牛血清蛋白标准溶液各1.0 m L于试管中，然后加入5.0 m L考马斯亮蓝G－250，充分振荡混合，放置5 min后，于595 nm处测吸光度A值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线，见图1，得线性回归方程为Y＝4.951 4 X－0.013 5（R2＝0.997 7）。

图1 牛血清蛋白标准曲线Figure 1 Standard curve of bovine serum albumin

（2）样品的测定：将离心后的牡丹籽粕蛋白溶液定容到100 m L，从中取1 m L再次定容到50 m L，得到待测液，之后取待测液1 m L按上述步骤测定吸光度A值，计算出样品中蛋白质的含量。

1.3.8 蛋白质提取率的测定 蛋白质提取率按式（2）计算：

式中：

R——蛋白质提取率，%；

c1——上清液蛋白质含量，mg／m L；

c0——脱脂牡丹籽粕蛋白质含量，mg／m L。

1.4 数据处理

所测结果均为3次重复试验的平均值，利用SAS 9.2软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 牡丹籽粕蛋白质酸沉等电点分析

由图2可知，在所测p H值范围内，牡丹籽蛋白的沉淀率随着p H的增大呈先增加后降低的趋势，在p H＝4时沉淀率最大，达94.55%。因此，在牡丹籽粕蛋白的酸沉工序中选择p H为4.0，可最大程度地沉淀蛋白质，提高提取率。

图2 p H对蛋白沉淀率的影响Figure 2 Effects of p H values on protein deposition rate

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对牡丹籽粕蛋白提取率的影响 由图3可知，料液比≤1∶15（m∶V）时，牡丹籽粕蛋白提取率随料液比的增加而增加，之后逐渐趋于不变。这可能是因为在料液比≤1∶15（m∶V）时，由于溶液的黏度较大，分子扩散速率较低，体系分散不均匀，影响了提取液中的蛋白质溶出，因此蛋白质的提取率较低［21］；随着料液比的增加，蛋白质的溶出较充分，因而提取率逐渐增大；但是过大的料液比不仅增加了水的消耗及后续的浓缩成本，而且容易导致加工过程中溶质的丢失［22］。因此，综合考虑上述因素，选择料液比为1∶15（m∶V）左右较为适宜。

图3 料液比对蛋白提取率的影响Figure 3 Effect of different solid－liquid ratio on protein yield

2.2.2 提取时间对牡丹籽粕蛋白提取率的影响 由图4可知，随着提取时间的延长，牡丹籽粕蛋白的提取率逐渐增加；当提取时间达到80 min时，牡丹籽粕蛋白的提取率达到最大，为79.57%；而提取时间过长可能会使部分蛋白变性导致提取率下降［23］，故选择提取时间为80 min较为适宜。

2.2.3 提取温度对牡丹籽粕蛋白提取率的影响 由图5可知，随着提取温度的升高，蛋白质提取率不断提高，当温度为45℃时提取率达最大，为80.17%。这是由于蛋白质分子的立体结构随着温度的升高而伸展，促进了蛋白质的溶解，并且水分子的热运动也加剧，蛋白质与水分子接触的几率增加，使溶解性进一步增加，从而提取率不断提高。但当提取温度超过45℃后，提取率反而有所降低，这是因为温度过高时维持蛋白质空间构象的次级键破坏，引起天然构象解体，导致蛋白质变性，故提取率下降［24］。综合考虑，提取温度选取45℃左右为宜。

图4 提取时间对蛋白提取率的影响Figure 4 Effect of different extraction time on protein yield

图5 提取温度对蛋白提取率的影响Figure 5 Effect of extraction temperature on protein yield

2.2.4 浸提液p H对牡丹籽粕蛋白提取率的影响 由图6可知，在p H为7～10时，蛋白质的提取率随着p H的增大呈上升趋势，且提取率在p H达到10时最大，为83.56%；当p H＞10时，提取率呈下降趋势。这可能是由于p H过高，强碱环境破坏了蛋白质的次级键，使蛋白质二、三级结构解体而引起变性所导致；同时p H值太高，在酸沉时会消耗大量的碱，导致产品中盐分增加，不利于后续的分离工序［25］。因此，浸提液p H选择为10左右较为适宜。

图6 浸提p H值对蛋白提取率的影响Figure 6 Effect of different extracting solution p H on protein yield

2.3 正交试验结果

碱提酸沉法提取牡丹籽粕蛋白的正交试验因素水平表见表1，试验结果见表2。

由表2可知，4个因素对牡丹籽粕蛋白提取率的影响顺序依次为A＞D＞C＞B，即提取时间＞料液比＞p H＞提取温度，最佳工艺组合为A3B3C3D3，即料液比1∶20（m∶V）、提取时间100 min、提取温度55℃、p H 11。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L9（34）正交试验设计与结果分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal test

2.4 验证实验

根据正交试验得到的最优工艺条件，进行3组平行验证性实验，测得牡丹籽粕蛋白的提取率分别为84.38%，86.51%，89.43%，平均值为86.77%，表明牡丹籽粕蛋白提取的最佳工艺切实可行。

3 结论

（1）采用碱提酸沉法提取牡丹籽蛋白，料液比对提取率的影响最大，其次为提取时间与p H，而提取温度的影响最小，各因素对牡丹籽粕蛋白提取率均有显著影响（P＜0.05）；提取最佳工艺条件为料液比1∶20（m∶V）、提取时间100 min、提取温度55℃、p H 11，在该条件下牡丹籽粕蛋白的提取率可达86.77%；牡丹籽粕蛋白的等电点为p H 4.0，沉淀率最大可达94.55%。

（2）试验结果表明，采用碱提酸沉法提取牡丹籽蛋白可行，可为牡丹籽综合利用提供技术参考。下一步将对牡丹籽粕蛋白质的氨基酸组成做进一步分析，以确定其具体应用方向。

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