刘 蕊 陈 敏 王 宏

LIU Rui 1 CHEN Min 1 WANG Hong 2

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310012；2.浙江凯胜生物药业有限公司，浙江 兰溪 321100）

（1.College of Food Science ＆ Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou，Zhejiang 310012，China；2.Zhejiang Chyszern Biological Pharmaceutical Co.，Ltd，Lanxi，Zhejiang 321100，China）

恩拉霉素（enramycin）是1966年由日本武田药品工业株式会社研究员从日本兵库县西宫市的土壤中分离出来的一株杀真菌链霉菌Streptomyces fungicidious NO.B－5477产生的一种多肽类抗生素［1－3］，具有广谱抗革兰氏阳性菌特性和优良的促生长性、改善饲料利用率的作用，且不易与其他抗生素产生交叉耐药性［4］。目前，对于发酵法生产恩拉霉素，国内外主要集中在高产菌种的选育、培养基及发酵条件优化方面的研究［5－7］。

恩拉霉素是胞内产物，所以恩拉霉素生产菌的生物量对于恩拉霉素产量的提高至关重要。恩拉霉素的生产菌隶属于链霉菌属，是好氧微生物，它的生长和恩拉霉素的合成都需要大量的氧气。但由于恩拉霉素发酵生产过程中使用的培养基固形物含量高，黏度大，生产过程中菌丝体易结团，导致发酵系统的溶氧速率较低。如果加大搅拌速率来增加溶氧量，则剪切力会增大，造成菌丝体的损伤，生产能力下降。因此在实验室及企业工业化生产中供氧成为提高恩拉霉素产量的主要限制因素之一。

近年来不少研究机构采用一些新方法来改善发酵过程中的氧传递问题，以提高细胞和产物浓度，如氧载体。有文献［8－10］表明，加入氧载体，可利用氧气在其中的高溶解度特性，将它们引入发酵液来降低传质阻力。氧载体发酵体系由于氧传递速度快，能耗低，气泡生成少，剪切力小的特点，受到广泛的应用。通常使用的氧载体有：液态烷烃、油酸、甲苯、全氟化碳、豆油等［11－14］。本研究拟考察不同氧载体对恩拉霉素发酵的影响，对其中效果最优的氧载体的添加时间和添加量进行单因素比较和响应面优化［15］，以期为将其进一步应用于扩大发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Streptomyces fungicidious KS 010：浙江凯胜科技有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

全温振荡培养箱：HZ－F160型，太仓市实验设备厂；

立式压力蒸汽灭菌锅：YXQ－LS－75Ⅱ型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

高效液相色谱仪：2478 DualλAbsorbance Detector，600 controller，717 plus Autosampler，Empower色谱工作站，美国Waters公司；

p H计：DELTA 320型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

生化培养箱：SHP－250型，上海森信实验仪器有限公司。

1.1.3 培养基及主要试剂

斜面培养基：可溶性淀粉 20.0 g／L，KNO31.0 g／L，K2HPO40.5 g／L，MgSO4·7H2O 0.5 g／L，NaCl 0.5 g／L，FeSO4·7H2O 0.01 g／L，琼脂20.0 g／L，p H 7.2～7.4；

种子培养基：玉米浆3.5%，可溶性淀粉3.5%，玉米蛋白粉0.5%，CaCO32.0%，适量泡敌，消后p H 7.0；

发酵培养基：葡萄糖5.03%，玉米淀粉3.5%，玉米浆2.0%，玉米蛋白粉 3.0%，NH4Cl 0.50%，NaCl 1.50%，酵母膏1.2%，K2HPO43H2O 0.15%，ZnCl20.12%，α－淀粉酶0.1%80～90℃糊化20～30 min，加 CaCO31.5%，适量泡敌，消后p H 7.0～7.5；

恩拉霉素预混剂（对照品）：含量10%，浙江海正药业股份有限公司；

Tween－80、乙酸乙酯、油酸、正十六烷、甲醇、丙酮：分析纯，浙江汇普化工仪器有限公司；

玉米蛋白粉、玉米浆、玉米淀粉、α－淀粉酶、豆油（食用级）：浙江凯胜科技有限公司；

乙腈：色谱纯，Honeywell Burdick ＆Jackson，USA。

1.2 培养方法

（1）种子扩培：取斜面活化菌种，接种于100 m L种子培养基中。28℃，200 r／min，摇瓶培养48 h。

（2）发酵培养：取种子扩培液，按15%（V／V）的接种量接 种 于 发 酵 培 养 基 中。33 ℃［7］，200 r／min，摇 瓶 培养10 d［7］。

1.3 测定方法

1.3.1 HPLC法测定恩拉霉素含量 准确量取一定体积发酵液，使用细胞破碎仪破碎10 min，将破碎后发酵液转移至100 m L容量瓶中，用浸提液定容至刻度，摇匀后28℃静置30 min。取出后4 000 r／min离心15 min，得上清液备用。

采用Waters液相色谱仪分析，色谱柱为C18色谱柱（5μm，4.6 mm ×250 mm），流动相为30%乙腈和70%的0.05 mol／L的 KH2PO4水 溶 液 （p H 4.5），检 测 波 长268 nm，流速1.0 m L／min［7］。

1.3.2 菌体浓度的测定 准确量取一定体积培养一定时间的发酵液于50 m L离心管中，8 000 r／min下离心5 min，倒出上清液，准确量取上清液体积。按式（1）计算菌体浓度：

1.4 氧载体优化试验

1.4.1 氧载体的选择 选择Tween－80、油酸、乙酸乙酯、正十六烷作为待测氧载体，在摇瓶发酵初始分别添加2%的量，以不添加氧载体为对照。在转速200 r／min，33℃的条件下培养10 d。通过测定各摇瓶菌体浓度和恩拉霉素相对含量，筛选促进恩拉霉素合成的最适氧载体。

1.4.2 最适氧载体添加量试验 在确定了氧载体的基础上，在发酵初始向发酵培养基中添加0.5%，1.0%，2.0%，4.0%，8.0%的最适氧载体，以不添加氧载体为对照，在转速200 r／min，33℃的条件下培养10 d。通过测定各摇瓶菌体浓度和恩拉霉素相对含量，确定最适氧载体的最佳添加量。

1.4.3 最适氧载体添加时间试验 在最适氧载体添加量试验的基础上，考察不同时间添加最适氧载体对恩拉霉素发酵的影响。试验中分别在0，2，4，6 d 4个时间点向发酵液中加入最佳浓度的氧载体，以不添加氧载体作为对照，在转速200 r／min，33℃的条件下培养10 d。通过测定各摇瓶菌体浓度和恩拉霉素含量，确定最适氧载体的最佳添加时间。

1.4.4 二阶响应曲面优化最适氧载体添加方式 在单因素试验基础上，以最适氧载体的加入量和加入时间为中心，体系中恩拉霉素产量Y为目标响应值，采用二阶响应曲面优化最适氧载体的添加量和添加时间，获得最优的添加方式。

1.4.5 验证实验 以二阶响应曲面优化所得到的最优添加方式重复验证3次，根据所得恩拉霉素含量的平均值与理论值间的差异，评价二阶响应模型的正确性。

2 结果与讨论

2.1 最适氧载体的选择

根据1.4.1项中方法进行试验，比较不同氧载体对恩拉霉素发酵的影响，不同氧载体体系得到的菌体浓度和恩拉霉素的相对含量结果见表1。

表1 添加不同种类氧载体对恩拉霉素发酵的影响Table 1 Effects of different oxygen－vectors on fermentation production of enramycin

由表1可知，以菌体浓度为指标，添加2%的乙酸乙酯、豆油和正十六烷试验组的菌体浓度均高于对照组，其中添加正十六烷试验组的菌体浓度可以达到53%，高于对照组13%。而添加Tween－80和油酸的试验组的菌体浓度均低于对照组。可见并不是所有的氧载体都可以提高恩拉霉素生产菌的菌体浓度。以恩拉霉素相对含量为指标，添加2%的豆油和正十六烷试验组的恩拉霉素相对含量均高于对照组，分别提高了39.57%和62.74%，说明这两种氧载体均可以提高恩拉霉素产量，并且对菌体生长无影响。而添加相同浓度的Tween－80、油酸试验组的恩拉霉素相对含量均比对照组低，说明这两种有机溶剂抑制菌体的生长，进而影响恩拉霉素的合成，可能是这些有机溶剂对菌体细胞的毒性或刺激性较大，生物相容性不好。此外，添加2%的乙酸乙酯，菌体浓度较对照增加了4%，但是恩拉霉素相对含量只有对照组的57.93%，可能是因为乙酸乙酯作为一种表面活性剂可以减小发酵液中气泡的直径，有利于发酵液中氧的传递，促进菌体浓度略微增加，但乙酸乙酯可能不利于恩拉霉合成，故其无法提高恩拉霉素的产量。根据表1结果，选择正十六烷作为最适氧载体开展后续试验。

2.2 正十六烷浓度对恩拉霉素发酵的影响

根据1.4.2项中方法，比较添加不同浓度正十六烷对恩拉霉素发酵的影响，不同浓度正十六烷体系下得到的菌体浓度和恩拉霉素的相对含量结果见图1。

图1 正十六烷添加量对恩拉霉素发酵的影响Figure 1 Effects of different concentration of n－hexadecane on fermentation production of enramycin

由图1可知，与未加入正十六烷的对照相比较，正十六烷的添加量为0.5%时，体系的菌体浓度增加了13%，恩拉霉素的相对含量提高了96.85%。当添加量超过1.0%时，菌体的生长开始受到抑制，但是对恩拉霉素合成的促进作用依然明显。当添加量达到4.0%时，菌体生长已经受到很明显的抑制，菌体浓度仅较对照提高了3%，恩拉霉素相对含量大幅下降，仅高出对照组31.45%。单因素试验结果表明，恩拉霉素发酵过程中添加0.5%正十六烷作为氧载体，可以改善发酵液中的溶氧情况，较好地促进菌体的生长及恩拉霉素的合成。

2.3 正十六烷添加时间对恩拉霉素发酵的影响

参照1.4.3项中的方法，在0，2，4，6 d分别添加0.5%正十六烷，比较正十六烷不同添加时间对恩拉霉素发酵的影响，结果见图2。

图2 正十六烷添加时间对恩拉霉素发酵的影响Figure 2 Effects of adding time of n－hexadecane on fermentation production of enramycin

由图2可知，在接种后48 h内添加0.5%正十六烷，均能提高菌体浓度和恩拉霉素产量，并且在48 h添加的效果最为明显，其菌体浓度及恩拉霉素含量分别较对照组提高了9%和76.39%，较0 h添加提高了2%和22.09%。而在接种48 h之后添加0.5%的正十六烷，菌体浓度和恩拉霉素相对含量逐渐下降，不及48 h添加正十六烷的效果好，说明恩拉霉素生产菌在生长对数期（48 h）对氧的需求更强烈，存在着溶解氧的不足，此时添加氧载体更有利于菌体的生长和后期恩拉霉素的积累。因此，恩拉霉素发酵过程中氧载体正十六烷较佳添加时间是在接种48 h（对数生长期）。

2.4 响应面试验设计与结果

综合以上单因素试验结果，采用响应面法优化氧载体正十六烷添加方式。以恩拉霉素含量（Y）为评价指标，对氧载体正十六烷的添加量（A）和添加时间（B）这两个因素进行响应面优化，响应面试验的因素水平见表2，响应面分析方案及试验结果见表3。

表2 响应面试验因素水平及编码Table 2 Factors and levels in the central composite experimental design

表3 响应面分析方案及试验结果Table 3 Design and results of the response surface methodology

采用Design－Expert软件进行二元回归拟合，得到恩拉霉素含量为响应值的回归方程：

回归方程分析见表4，正十六烷的添加量与添加时间的响应面与等高线图见图3。

表4 回归方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

由表4可知，B、A2、B2对Y（恩拉霉素含量）的影响极其显著。模型方程的F 值为143.15，Prob＞F 的值＜0.000 1，说明模型是极其显著的，而失拟项的F值为2.34，Prob＞F的值为0.215，说明是不显著的。回归方程相关系数R2＝0.980 3，高度显著，说明响应值（恩拉霉素含量）的变化有98.03%来源于所选变量，因此该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，使用该方程进行真实的试验点分析是可靠的。由响应面图（图3）可知，正十六烷的最优添加时间为44.10 h，最优添加量为0.72%，该条件下恩拉霉素理论最高含量为2 964.26 mg／L。

2.5 优化参数验证

在正十六烷最优添加方式下进行验证实验，重复3次，结果表明，在此条件下得到恩拉霉素含量平均值为2 940.65 mg／L，与理论预测值的相对误差在0.80%，因此采用响应面法优化得到的二次多项式回归方程准确、可靠。实际测得生产菌菌体浓度较对照提高了23%，恩拉霉素含量比对照组（1 733.51 mg／L）提高了70%。

图3 正十六烷的响应面和等高线图Figure 3 Response surface and contour lines of nhexadecane

3 结论

恩拉霉素发酵生产属于好氧型发酵，但是发酵过程中使用的培养基黏度大、固形物含量高，发酵过程中菌丝体容易结团，导致发酵系统的溶氧速率降低。传统供氧方式通常是采用大通气量及高速搅拌速率相结合，但是高机械强度会增强剪切力，造成菌丝体的损伤，使菌丝体受损不能正常代谢，生产能力下降，同时操作成本也会大幅度增加。因而供氧成为制约恩拉霉素发酵过程中生物反应的重要因素，而氧载体发酵体系由于具有剪切力小、能耗低、氧传递速度快等特点，近年来成为新的研究方向，而氧载体应用于恩拉霉素方面的文献鲜有报导。

油酸、豆油、正十六烷是常用的氧载体，其铺展系数为正值，氧在其中有更高的溶解度，其中氧在正十六烷中的溶解度比其在水中的高8倍［16］。郝冬霞［17］发现61.6 h添加体积分数为0.123的正十六烷可以提高庆大霉素的生产效价20%以上。王启军［18］在黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶过程中添加油酸作为氧载体能够促进产酶。刘元帅等［19］将体积分数10%的正十六烷添加到红法夫酵母发酵培养基中，使红法夫酵母单位类胡萝卜素合成能力提高了18%。

本研究首先对多种有机溶剂作为氧载体的效果进行比较，发现并不是所有的氧载体均适用于恩拉霉素的发酵。其中Toween－80和油酸两种有机溶剂对菌体细胞的毒性或刺激性较大，生物相容性不好，会抑制菌体生长，进而影响恩拉霉素合成；而豆油和正十六烷作为氧载体均可以有效提高生产菌菌体浓度和恩拉霉素产量，但豆油添加量过大，且发酵结束后不易分离，生产成本大幅增加，所以选择正十六烷作为恩拉霉素发酵中最适添加氧载体。接着对氧载体正十六烷的添加量和添加时间进行响应面优化，结果显示在44.10 h添加0.72%的正十六烷可以使生产菌菌体浓度较对照提高23%，使恩拉霉素产量提高70%。因此，添加正十六烷能加强发酵液中氧传递，提高溶氧水平，从而促进菌体生长及恩拉霉素合成。

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