李春远，丁唯嘉，王秀芳，罗志刚，谷文祥

（1.华南农业大学 理学院，广东 广州 510642；2.广东药学院 药科学院，广东 广州 510006）

天然药物化学是运用现代科学技术和方法研究天然产物中活性成分的学科［1］，是中药学、药学、制药工程、有机化学、应用化学等药学或化学类相关专业本科或硕士研究生的一门专业课，具有很强的实践性，其中的天然药物主要是指陆生中草药。随着研究的深入，药物资源从陆地拓展到海洋，为适应这种新的进展，《天然药物化学》（第5版，人民卫生出版社）教材新增了第十章“海洋天然产物”［2］。天然药物化学实验课程在天然药物化学教学中占有重要的地位，是理论知识和实际操作的纽带，通过实验不仅能够使学生掌握天然药物有效成分提取、分离和结构鉴定的基本操作技能，而且能够更好地培养学生的科学思维以及创新意识与创新能力［3］。然而目前国内各高校开设的天然药物化学成分提取分离实验的研究对象主要包括大黄、槐米、汉防己、麻黄、肉苁蓉等，几乎全部为陆生植物，少有报道在天然药物化学实验教学中开设有关微生物或海洋天然产物的实验内容，学生缺乏对微生物及海洋天然产物研究意义和研究方法的直观认识，不利于对天然药物化学课程相关内容的学习。我们提出在天然药物化学、天然有机化学等相关专业的实验课程中，优选实验内容开设海洋微生物天然产物提取分离综合性实验，以充分发挥实验教学平台的作用，促进学生对天然药物化学更加全面深刻的认识。

1 优选实验对象及实验目标产物

传统海洋天然产物的研究对象海藻、海绵等无脊椎动物［4］，数量有限，采集会对生态平衡造成一定破坏，而以海洋微生物为对象则具有成本低、可人工发酵、环境友好等特点［5］。海洋微生物包括海洋真菌、细菌等，其中海洋真菌发酵耗时长，静置培养通常需要25d左右，摇床培养也需要14d左右，而细菌发酵周期则较短，摇床培养仅需3～7d。因此，从学生实验的时效性考虑，海洋细菌成为首选。另一方面，作为学生实验，不宜以未研究过的新奇菌株为对象。

Bacillus sp.是一类在自然界分布广泛的革兰氏阳性菌，其代谢产物绝大多数为生物碱，种类相对单一，主要包括环二肽和大环脂肽类化合物［6－9］。其中环二肽等小分子生物碱不仅具有广泛的抗菌、抗肿瘤等生物活性［10］，而且组成单元相对固定，结构鉴定和分离纯化等实验流程易于重复。因此，在任课教师科研项目研究成果的基础上，我们选择一株分离自湛江海岸泥沙的芽孢杆菌Bacillus sp.ms12为对象。该菌主要代谢产物为色氨酸和环（苯丙－脯）二肽，我们以这2种物质为目标产物，优化菌株发酵条件、优选提取分离纯化方法，设计了适合于相关专业本科生和研究生开设的综合性实验方案。

2 优化发酵条件

为提高学生实验的效率，先通过单因素法结合正交试验优化了菌株Bacillus sp.ms12的发酵条件。优化后的实验发酵条件为：蛋白陈7g，酵母粉3g，牛肉膏3g，葡萄糖2g，海盐25g，水1 000mL，接种量5%，摇床振荡培养7d。在上述发酵条件下，每实验小组仅需发酵0.6L即可分别成功分离到10mg左右的色氨酸和环（苯丙－脯）二肽。无论是发酵量、发酵时间还是目标产物产率等，都十分适合学生综合性实验开设的要求。

3 优选提取、分离及纯化方法

3.1 采用大孔吸附树脂进行提取

微生物代谢产物提取实验通常使用有机溶剂如乙酸乙酯、正丁醇等直接对发酵液萃取的方法［11－12］，该方法消耗溶剂量大［13］、萃取时间长、收率低［14］，在萃取过程中还经常由于相分离不完全而产生乳化现象［15］等。相对于传统的有机溶剂液液提取方法，大孔吸附树脂由于具有低消耗、高效率、高选择性、后续处理简单并且可再生等优势，在农药、生化药物的分离纯化以及中成药的制备等方面的应用越来越广泛［16－19］。因此，从学生实验高效化、绿色化的角度考虑，我们采用了大孔吸附树脂法替代有机溶剂提取法。

根据文献报道，4g的XAD－16型大孔树脂可吸附高达1L海洋微生物Chromocleista sp.发酵液中的环二肽等小分子含氮化合物［20］，表明该树脂对小分子生物碱具有优秀的吸附能力。我们的预实验表明XAD－16树脂应用于菌株Bacillus sp.ms12，对发酵液中代谢物质的静态吸附量可达到树脂体积的7～10倍，并且所吸附的生物碱物质较易被无毒的洗脱剂乙醇水溶液解吸出来，用2～3倍树脂体积的70%乙醇的水溶液即可使其基本解吸完全。该方法既克服了液液萃取过程中溶剂挥发对环境的污染，又节省大量的有机溶剂，并且树脂再生后可以继续使用，既节能又环保。

3.2 引入超声波法进行洗脱分离。

目前对饱和大孔吸附树脂解吸主要有动态洗脱和静态洗脱2种方式［21］。其中动态洗脱采用饱和树脂装柱，然后用蒸馏水及不同洗脱剂将吸附物洗脱出来。这种洗脱方式由于树脂置于色谱柱中无法使用超声等加速解吸，需要消耗相对较多的溶剂和时间以保证洗脱完全。超声提取技术利用超声波的空化作用可加速欲提取成分的溶出，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等，也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取［22］。因此，有必要在解吸过程中使用超声波辅助以提高效率。

我们设计采用了动静态洗脱相结合的方式：将饱和树脂置于三角瓶中，先用蒸馏水浸泡，超声5min，用布氏漏斗抽滤，滤液保留备用；然后将树脂重新转移至三角瓶中，依次用50%乙醇水（用来除去非目标产物的干扰杂质）、70%乙醇水（洗脱出目标产物）及乙醇（洗脱出柱中的其他成分）洗脱剂重复上述步骤。与普通动态洗脱相比，本方法只用1／3的溶剂即可洗脱出相同的提取量，同时还节省了大量的时间和能源。本步完成后继续用蒸馏水对树脂进行洗涤至无醇味，树脂即可再次循环使用。对于收集到不同洗脱溶剂的滤液采用旋转蒸发仪代替普通蒸馏装置进行减压蒸馏，可以在较低的温度下温和又快速地对样品进行浓缩，同时又减少了因试剂挥发到空气中而污染环境，收集到的试剂还可以回收再利用。

3.3 利用制备薄层纯化单体化合物

制备薄层层析原理与柱层析相似，都是利用硅胶吸附性能使得不同物质在各种极性溶剂条件下解吸能力差异而进行分离纯化［23］。在具体实验操作上，柱层析需要经过装柱、压柱、上样、不同溶剂洗脱及洗脱液浓缩检识合并等步骤，由于样品从柱底流出且柱体积相对较大，导致解吸过程缓慢，需要消耗大量溶剂，耗时较长。制备薄层层析使用自制或购置的薄层板，由于薄层均匀严实，不存在气泡，其分离效果要优于柱层析。同时制备薄层置于展开缸中层析，所需溶剂量大大减少，展开后可根据紫外或显色剂检视刮取目标物色带，直接用少量大极性溶剂在短柱中洗出即可。因此相对而言，制备薄层层析更加简便快速且绿色化，更适合学生实验少量样品的分离纯化。

点样是制备薄层层析操作的关键，由于分离的样品量大，一般不使用圆点点样而采用条带点样。若用常规的玻璃毛细管或滴管带状点样，容易划伤薄层，且常出现上样浓度分布不均匀、上样带太宽或不齐等情况，影响分离效果。对此，我们采取的解决措施为在滴管头处塞上一小段脱脂棉，慢慢将样品刷到制备薄层板上。制备薄层层析方法对菌株Bacillus sp.ms12的70%乙醇水分段提取物进行纯化，效果良好，在1.5h内，只用100mL试剂即可获得15mg色氨酸和8mg环（苯丙－脯）二肽2种目标产物。

4 用核磁共振氢谱法（HNMR）对实验产品进行表征

核磁共振是天然产物结构鉴定及化学反应机理研究等最常用的工具之一［24－25］，但现有教材提供的天然产物的核磁共振谱图数量很少，且多数比较陈旧，同时由于不是自己分离得到，学生在学习结构解析时普遍缺乏兴趣，积极性不高。在此现状下，我们把HNMR融入到海洋微生物代谢产物分离纯化实验教学中，引导学生利用所学的理论知识解析自己所分离的化合物的结构。

学生首先对薄层纯化所得产品进行薄层检视，选取薄层层析中斑点单一、纯度高的样品。样品真空干燥后，装入核磁管，随后放入核磁共振仪，依次输入进样、锁场、匀场、采样等指令得到谱图。教师引导学生从峰的种类与质子、积分高度与质子数、化学位移数值与官能团（基团）关系等几处入手，学生通过认真观察分析得出结果。分析图1，鉴定出化合物1为环（苯丙－脯）二肽，分析数据与文献［26］基本一致。分析图2，推测分子是色氨酸，数据与色氨酸标准品HNMR数据符合。

图1 实验分离到的环（苯丙－脯）二肽的HNMR谱

图2 实验分离到的色氨酸的HNMR谱

学生完成上述结构解析后，教师引导学生依次思考如下问题：

（1）如何运用HNMR判断所分离物质中有无杂质？

（2）自己所分离的化合物的纯度情况如何？

（3）杂质未被充分除去的原因？

（4）如何进一步增加所分离化合物的纯度？

学生运用学到的知识结合教师提示和自己的实验操作等环节解决问题，给出答案。此步骤由学生在撰写实验报告阶段完成。学生为用HNMR谱表征自己分离得到的产品结构而感到高兴，整个过程激发了学生的成就感与创新欲望，使学生较好地掌握了HNMR谱表征与推知天然产物结构的方法。

5 结束语

与陆源生物的次生代谢产物相比，海洋生物由于生活环境更加复杂、物种更加多样，使得其天然产物具有很多新型的骨架和独特的化学结构，在生物活性方面也具有更强烈的作用。近年来，国内外天然产物学家普遍认为从海洋微生物发掘活性物质是利用海洋天然产物结构多样性，同时解决生物资源难再生、保护生态环境的最佳选择。海洋微生物已成为寻找药物先导化合物的一个新的源泉［27］。与此大背景不相符的是当前国内高校极少开设海洋微生物天然产物提取分离实验，究其原因，主要是因为微生物发酵周期长、代谢产物成分复杂，同时提取分离纯化过程需消耗大量溶剂，耗资且耗时。针对上述困难，我们依托于自身科研项目，精选一株代谢产物较为简单的海洋细菌为实验对象，限定目标产物，以绿色化学思想为指导设计实验方案，通过优化菌株发酵条件、优选提取分离纯化方法，不仅使实验学时、菌株发酵量、溶剂消耗、环境污染等降到最低，而且确保高效率地分离纯化出目标产物，并指导学生运用HNMR鉴定产物结构。该实验有助于学生全面深刻地认识海洋微生物天然产物的科学研究流程、增加学生学习兴趣、提升学生操作技能和创新能力。实验所积累的大量单体化合物还可以进一步加以利用，进行各种生物活性测试或开展结构修饰研究，成为大学生研究性或设计性实验项目的原料，衍生出更多新的创新内容。

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