李影　张东浩

【摘要】 目的 探讨尿液结核分枝杆菌检测在肾结核诊断中的应用价值。方法 对108例已确诊为肾结核的患者尿液标本分别采取抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR三种方法进行检测， 其结果进行分析。结果 抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR检测尿液中结核分枝杆菌的阳性率分别为25.9%、51.9%、72.2%。结论 尿液结核分枝杆菌检测属病原学检测， 特异性好、操作简便， 对肾结核的诊断有着重要的应用价值。

【关键词】 尿液；结核分枝杆菌；肾结核；诊断

结核病是全球严重的公共卫生问题之一， 据WHO估计， 全球有约20亿人感人结核分枝杆菌， 每年有约200万人死于结核病[1]。近年来， 随着结核病发病率在全球范围内的回升， 肾结核的发病率也明显增加。据统计， 全球每年有近千万人感染结核病， 而肾结核约占其中的8%～20%。该病进展隐蔽， 发现时， 肾功能已部分或完全丧失， 患者早期诊断困难， 以致延误治疗， 对人们的身体健康危害极大。因此早诊断对治疗尤为重要。在众多辅助检查中， 除病理诊断外， 实验室病原学检查具有较高的特异性， 且操作简便， 患者无痛苦。现就最常用的抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养、荧光定量PCR三种检测方法进行分析， 评价其在尿液结核分枝杆菌检测对肾结核诊断的应用价值。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 2010年11月～2013年10月本院住院的肾结核患者， 共计108例。男性58例， 女性50例。其中小于20岁者7例， 大于40岁者27例， 20～40岁者74例， 占68.5%；单侧肾结核87例， 双侧肾结核21例；合并其他脏器结核病（如肺结核、脊柱结核、肠结核、附睾结核等）65例， 约占60.2%。

1. 2 标本收集

1. 2. 1 抗酸菌涂片染色检测 留取12 h尿液， 静置， 倾去上清液， 留取沉淀部分30 ml， 以3000 rpm离心30 min， 弃上清， 取沉淀物涂片。

1. 2. 2 改良罗氏培养和荧光定量PCR检测 嘱患者留取晨尿， 因晨尿浓缩， 适用于做病原学检查。在留取尿液之前先用消毒液清洗外阴， 以去除污染菌。分别留取中段尿约20～30 ml于一次性无菌塑料标本杯中各一杯。为提高检出率， 所有患者均连续留取3 d标本， 置于2～8℃冰箱中贮存， 于3 d后将尿液混合进行改良罗氏培养和荧光定量PCR检测。如患者正在进行抗结核药物治疗时， 应停用所有抗结核药一周， 以提高结核杆菌的检出率。

1. 3 试剂与仪器

1. 3. 1 抗酸菌涂片染色 试剂由珠海贝索生物技术有限公司提供。无需特殊仪器。

1. 3. 2 罗氏培养 改良酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供。隔水式培养箱由天津市泰斯特仪器有限公司提供。

1. 3. 3 荧光定量PCR 由中山大学达安基因股份有限公司提供试剂。仪器LightCycler 3.5全自动荧光定量基因扩增仪由罗氏公司提供。

1. 4 方法

1. 4. 1 抗酸菌涂片染色 取制备好的尿沉淀物0.05～0.10 ml均匀涂于玻片上， 直径约2～3 cm， 火焰固定。滴加石碳酸复红染液布满标本， 保持3～5 min。流水自玻片一端冲洗洗去染液， 沥干剩余水分。滴加3%的盐酸酒精， 1～3 min后流水冲洗沥干。滴加美蓝染液， 0.5～1 min后流水冲洗沥干。置于干燥箱中干燥后镜检。

1. 4. 2 改良罗氏培养 将标本进行离心， 以2000 rpm/min离心3 min为宜， 取离心沉淀后的尿沉渣标本0.1～0.3 ml， 以无菌操作接种于培养基斜面上， 一般每份标本同时接种2支培养管。将接种好的培养管置于35～37℃培养箱中孵育， 5%～10%的CO2可以促进分枝杆菌的生长， 培养管须松盖倾斜放置24 h后再将盖子锁紧， 垂直放置。接种并孵育第一周需每天判读一次菌落生长情况。此后每周判读一次， 记录菌落生长及污染情况。判读如发现斜面培养基上有菌落出现， 须挑取菌落做成涂片进行抗酸染色镜检。

1. 4. 3 荧光定量PCR 取底部尿液标本10～15 ml离心管中15000 rpm离心5 min。去上清， 沉淀加无菌生理盐水1 ml打匀， 15000 rpm离心5 min， 去上清。加50 μl DNA提取液充分混匀， 100℃浴温10 min， 待自然冷却后， 10000 rpm离心5 min， 取上清液2 μl加入专用毛细管中4000 rpm离心3 min， 插入圆形卡盘倒置20 s后放入仪器中进行循环扩增。步骤为：93℃→2 min预变性， 然后按照93℃5 s→57℃45 s， 做40个循环， 最后置37℃延伸1 s。整个过程严格执行无菌操作， 扩增及结果判读， 由电脑自动完成。

2 结果

三种方法检测尿液结核分枝杆菌的阳性检出率分别为抗酸菌涂片染色法25.9%（28/108）， 改良罗氏培养法51.9%（56/108）， 荧光定量PCR法72.2%（78/108）。

3 讨论

近年来临床不典型肾结核发病率有增加的趋势[2]， 此外， 超过1/2的肾结核患者伴有全身其他部位的结核菌感染， 所以发现全身其他部位的结核病灶时， 应进行全面检查是否存在肾结核等结核性疾病， 而全身其他部位的结核病灶也支持肾结核的诊断。

在肾结核的诊断方法中， 主要为影像学检查和病原学检查。影像学检查中， B超检查对早期肾结核的诊断意义不大， 只适合肾结核初筛和治疗后的复查[3]。IVU或CT的典型表现对中晚期肾结核具有确诊价值[4]。因此， 病原学检查对肾结核的早期诊断尤为重要。

抗酸菌涂片染色检查是实验室最基本的细菌学检查方法。其优点是操作简便、快速， 无需任何设备， 廉价， 1～2 h即可回报结果， 对结核病早期诊断和病程的发展、转归起着重要作用；缺点是受人为因素影响大， 灵敏度低， 检出率一般只有25%～28%。通常需5000～10000条菌/ml才能得到阳性结果。endprint

改良罗氏培养法的优点是灵敏度较高， 不易被污染， 特异性好， 操作简便， 无需特殊仪器设备， 并可结核抗酸菌涂片检测来鉴定死菌与活菌， 还可以进一步药物敏感性的鉴定， 为临床用药提供可靠依据， 被誉为结核病诊断的“黄金标准”；缺点是费用高， 操作流程长， 通常需6～8周才能获得结果。

荧光定量PCR是一种密闭的扩增检测系统， 所检测的是结核分枝杆菌的特异DNA片段， 具有敏感度、特异度高及方便快速、自动化程度高等优点， 特别是对难以培养与生长缓慢的结核杆菌的检测更有优势[5]。只需极少量的病原标本， 即可及时准确的判定结果。阳性下限仅为10个拷贝/ml， 操作简单， 只需2～3 h即可完成。缺点是实验室环境要求极高（需按照相关法律法规的标准建设实验室并提交主管部门审批合格）， 因其检出率高， 故而极微量的污染就可能造成假阳性结果。因此需联合多项实验室检查可以提高肾结核诊断的特异性和敏感性。

综上所述， 尿液结核分枝杆菌的检测是诊断肾结核的关键， 且尿标本简单易取， 取样不会给患者带来痛苦和增加感染机会， 特异性好， 灵敏度较高， 对肾结核的早期诊断有明显的优势。因此， 不难看出尿液结核分枝杆菌检查对临床肾结核以致泌尿系结核的诊断具有无可替代的重要作用。

虽然尿液结核分枝杆菌检测对肾结核的诊断发挥着相当重要的作用， 但其检测方法的的灵敏度和特异性还有待进一步提高， 且易出现假阴性和假阳性。因此， 完整的肾结核诊断仍然需要将病史、临床表现、实验室检测、影像学分析、病理学诊断等方法相结合进行综合分析， 才能提高肾结核早期诊断率， 为进一步的正规抗结核治疗赢得时机。

参考文献

[1] 张瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等.结核感染T细胞斑点试验再结核性疾病中的诊断价值.中华临床医师杂志（电子版）， 2010， 12（4）：2431-2434.

[2] 石莺，黄建军.45例肾结核临床病理分析.现代医药卫生， 2005， 2（21）：133-135.

[3] 李邦国，戴辉，蔡争，等.肾盂造影、CT对肾结核的诊断价值.医学理论与实践， 2005，18（1）：132-133.

[4] 裴林惠，丁建国.肾结核的CT诊断.中国基层医药， 2006， 11（1）：32-33.

[5] 彭丽，罗永艾.结核病的实验室快速诊断.新医学， 2005， 36（1）： 359-361.endprint