闫玉兰，郭世辉，李 萌，吴晓宁，梁宏洁（广西医科大学第一附属医院检验科，南宁 530021）

铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，常对多种抗菌药物天然耐药，碳青霉烯类药物[亚胺培南、美罗培南等]是临床用于治疗铜绿假单胞菌感染的常用抗菌药物。然而，随着碳青霉烯类药物在临床上的广泛应用，铜绿假单胞菌对此类药物的耐药率也明显升高。有文献报道铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药主要是由胞壁屏障机制所致，由碳青霉烯酶所致的耐药只占极少部分[1]。现将广西地区铜绿假单胞菌中外膜蛋白D2（OprD2）的缺失与亚胺培南耐药之间的关系分析报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 选择2011年6月至2012年12月广西医科大学第一附属医院各科住院患者的各类临床标本。同一患者分离得到的菌株不重复计入。质控标准株ATCC27853由卫生部临床检验中心提供。

1.2 主要试剂 水解酪蛋白（MH）琼脂粉（杭州天和微生物试剂有限公司）；抗菌药物亚胺培南粉剂（美国默沙东制药公司）；细菌膜蛋白提取试剂盒购于上海炎彬公司，蛋白marker购于TaKaRa公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司，考马斯亮蓝快速染色液购于上海双螺旋生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 VITEK 2和ATB鉴定仪（法国梅里埃公司），MINI垂直电泳槽、恒压恒流电泳仪、凝胶成像分析仪（Bio－Rad公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌株鉴定 用梅里埃的VITEK－2和ATB鉴定仪进行鉴定。

1.4.2 耐药菌株的筛选 参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）2012年标准，用琼脂平皿二倍稀释法测定铜绿假单胞菌对亚胺培南的最小抑菌浓度（MIC）值，MIC≥8为耐药。

1.4.3 水杨酸盐抑制实验[2－3]将对亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌株分别接种于含有和不含32mmol／L水杨酸钠的MH平板上，再将亚胺培南药敏纸片分别贴在两个平板上，将平板置于37℃培养箱中培养18～24h，观察亚胺培南抑菌圈的大小。

1.4.4 外膜蛋白的提取与制备 根据试剂盒里的说明书提取细菌的膜蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白配制成5.0mg／mL的浓度，并于－80℃储存备用。

1.4.5 蛋白质电泳 将蛋白样品与样品缓冲液以4∶1的比例混匀，100℃加热5min以使蛋白质变性。通过SDS－PAGE电泳（分离胶浓度为10%）分离外膜蛋白，电泳时浓缩胶的电压为80V，分离胶的电压为120V。然后用考马斯亮蓝快速染液染色、脱色，并用凝胶成像系统成像。

1.4.6 外膜蛋白位置的确定 将上述在含和不含32mmol／L水杨酸钠的MH平板上生长的对亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌分别转种到肉汤培养基中，水浴震荡过夜。提取细菌的外膜蛋白并SDS－PAGE电泳。利用铜绿假单胞菌OprD2能被水杨酸盐抑制的特性[4]以确定外膜蛋白的位置。

2 结 果

2.1 铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药情况 共检出亚胺培南耐药株106株，其对亚胺培南的MIC值均大于或等于16μg／mL；30株亚胺培南敏感株的MIC值均小于或等于2μg／mL。

2.2 水杨酸盐抑制实验结果 对亚胺培南敏感的铜绿假单胞菌，在含32mmol／L水杨酸钠的MH平板上生长，亚胺培南抑菌圈直径小于或等于12mm，即对亚胺培南耐药；而在不含水杨酸钠MH平板上生长的亚胺培南的抑菌圈直径大于25mm，即对亚胺培南敏感。

2.3 外膜蛋白位置的确定 在含水杨酸钠平板上生长的菌株不表达OprD2（即OprD2蛋白缺失），生长在不含水杨酸钠平板上的菌株则表达OprD2蛋白（即OprD2蛋白不缺失），可由此确定铜绿假单胞菌的OprD2的位置。

2.4 SDS－PAGE凝胶电泳结果 铜绿假单胞菌ATCC27853及亚胺培南敏感株均在45×103处出现了OprD2蛋白条带，在106株亚胺培南耐药菌中，有99株在45×103处未出现OprD2蛋白条带，缺失率为86.8%，其余7株亚胺培南耐药株未出现OprD2的缺失。

3 讨 论

铜绿假单胞菌细胞壁两侧有内、外两层膜，其外膜蛋白本身的通透性不高，缺乏其他多数革兰阴性菌具有的“典型”高通透性孔蛋白，仅存在着低通透性微孔蛋白形成的小孔道，只允许小分子亲水性物质跨膜扩散，对进入菌体的药物具有选择性，因此外膜结构在抗菌药物耐药中担任重要的角色[4]。铜绿假单胞菌有多种外膜蛋白，其中OprC（70×103）、OprD2（45×103）、OprE（43×103）均有孔道活性，其中外膜孔蛋白OprD2孔道被认为是小分子碳青霉烯类药物选择性快速进入菌体的特异性通道[5]。

以亚胺培南为代表的碳青霉烯类药物是目前临床用于治疗铜绿假单胞菌感染应用最广也是效果最好的药物之一，亚胺培南药物是以细菌内膜上的青霉素结合蛋白PBP－2及PBP－3为作用靶位的，但药物必须要通过细菌的外膜才能到达作用靶位，而OprD2是亚胺培南进入细菌的特异性通道[6]，编码OprD2的结构基因OprD位于染色体上，编码基因OprD的突变可使OprD2蛋白表达减少甚至缺失，所以当OprD2缺失或表达减少时可导致菌体外膜通透性改变从而使得碳青霉烯类药物进入菌体受到阻碍，在临床上表现为铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药。除此以外，OprD2还能形成碳青霉烯类药物特异性结合位点，是目前所知的铜绿假单胞菌中唯一有助于抗菌药物通过的孔道蛋白[7]。因此，外膜蛋白OprD2缺失是介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制之一[8]。而β－内酰胺类抗菌药物如青霉素或头孢菌素的作用机制是通过抑制胞壁黏肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），从而阻碍细胞壁黏肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。多数青霉素类或头孢菌素类抗菌药物主要与PBP1和（或）PBPs结合，形成丝状体和球形体，使细菌发生变形萎缩，逐渐溶解死亡[9]。即β－内酰胺类抗菌药物如青霉素和头孢菌素等不能通过OprD2，因此，以亚胺培南为代表的碳青霉烯类药物与β－内酰胺类药物无交叉耐药性[10－11]。

本次研究发现，106株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中，99株OprD2缺失，缺失率为86.8%，由此可推断OprD2的缺失在介导本院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中起着重要的作用。其余7株亚胺培南耐药株未出现OprD2的缺失，说明介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的还有其他的机制，如产生β－内酰胺酶[12]、主动外排泵的存在等[13－14]。本次研究中，OprD2的缺失率为86.8%，这与颜英俊等[15]对34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床标本用PCR方法扩增OprD基因并对扩增产物进行DNA分析后发现，对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌的OprD基因突变率达高92.3%的研究结果相似。颜英俊等的研究还发现OprD基因突变的方式主要有点突变、缺失突变以及插入突变等。细菌因发生基因突变而引起OprD茎环结构L2、L3和亚胺培南药物主要结合位点氨基酸发生替换和移位突变，最终导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药[16]。国外也有与颜英俊类似的报道，如Yoneyama等[17]研究发现，OprD2基因缺失存在缺失突变，编码区DNA片段发生缺失，导致移位突变，并形成1个位置提前的新终止密码子进而引起其肽链异常，最终导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药[18]。这说明OprD2的缺失是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的重要机制之一。

本研究OprD2缺失率为86.8%，而2010年哈尔滨地区的OprD2缺失率为26.19%（42株耐亚胺培南菌株中11株完全缺失）[11]，2007年北京一所医院的OprD2缺失率为56.10%[19]，这与本研究的OprD2缺失率有差异，可能是地区不同而导致的差异或研究的年份不同而导致的差异。本研究只是针对广西地区耐亚胺培南的铜绿假单胞菌进行耐药机制的研究，对OprD2的缺失仅作了定性分析，OprD2的表达量与铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药程度之间的关系有待作进一步研究。

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