缪黄泰，聂绍平

(首都医科大学附属北京安贞医院急诊危重症中心，北京100029)

近年来，随着细胞生物学技术的发展，人们对于细胞去分化的关注日趋增多。研究细胞去分化也不仅仅局限于细胞本身改变等微观层面，已经延伸至哺乳动物功能改变等宏观层面，并为去分化由基础研究向临床应用转化奠定了良好的基础。去分化是指已经分化成熟的细胞，改变原有的分化程序，失去原有的结构和功能，变回相对原始幼稚的状态。现有研究证实，在动物界，除了蚯蚓、两栖类动物、斑马鱼等具有很强的再生能力之外，哺乳动物和人类的表皮细胞、脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、肝细胞、浆细胞以及部分肿瘤细胞等同样具备一定的再生潜力，均存在去分化现象。本文就细胞去分化相关研究阐述去分化用于细胞治疗的前景。

1 在体去分化现象的研究

部分活体动物在发生炎性反应、肿瘤以及遭受创伤后，在自我更新和修复过程中，存在细胞去分化现象。这一现象可以出现在不同的组织中例如，神经组织、皮肤组织及肌肉组织等，并伴随一系列生物学反应。细胞水平、蛋白水平和基因水平等均可以检测到相应的变化，并能够在病理上得到一定证实。

通过大鼠坐骨神经的远端残留神经横断面检测的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的活性水平，发现坐骨神经横断，即轴突的损伤可以产生一种强大而持久的信号，可以诱导相应施旺细胞ERK信号的增强，进而诱导细胞去分化［1］。同样将去除基底层细胞的人类表皮贴片用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)标记后移植到全层皮肤受损的裸鼠身上，移植后7 d，对棘细胞层和颗粒层的免疫组化分析显示部分细胞DAPI以及CK19和CK14或者β1整合蛋白呈现阳性［2］。这些结果表明，在体内部分已经分化的表皮细胞发生去分化，从而转变为表皮干细胞或表皮干细胞样细胞。经过形态学等方法检测，这些去分化得到的表皮干细胞不仅形态类似于正常表皮干细胞，而且其核型检查也与正常表皮干细胞相一致。如果将出生后1 d的小鼠的部分心脏组织切除，可以在心脏切除部分观察到有大量的心肌细胞呈现出紊乱的肌节结构，这种增生反应在切除后7 d达到顶峰，并且遍及整个心脏组织，这些发现与新生小鼠心脏心肌细胞具备广泛去分化和增殖的再生潜能相一致，而这种再生能力在小鼠出生7 d后消失。遗传原基分布图对再生部分心肌细胞的起源谱系进行分析表明，这些心肌细胞来源于心肌细胞谱系而不是非特异性心脏干细胞［3］。在配对基因盒5(Pax5)缺失的小鼠体内，外周淋巴器官的成熟B细胞可以去分化形成骨髓中早期未分化定型的祖细胞，可以挽救胸腺中T淋巴细胞缺陷小鼠的T淋巴细胞生成。这些B细胞来源的T细胞，不仅携带免疫球蛋白重链和轻链基因重组，而且和功能性T细胞一样参与免疫反应［4］。对于肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)遗传模型的研究，发现去分化还与肿瘤细胞存在密切关系。NF-κB是炎性肿瘤微环境中的一个关键转录因子，能够调节Wnt信号，升高的NF-κB信号可以增强Wnt信号激活和诱导表皮细胞发生去分化转变为肿瘤起始细胞。

2 体外去分化现象的研究

动物细胞脱离在体环境后，可以在体外通过添加诱导剂或模拟在体环境，同样能够发生去分化。这种去分化常常对生物学信号存在一定的依耐性，一些化学分子可以作为多功能诱导剂，可以有效诱导多种细胞发生去分化。去分化后得到的相对原始的细胞，其功能学也发生相应变化。

取大鼠坐骨神经的施旺细胞进行体外培养发现，Raf信号通过ERK途径阻断并反转细胞分化，即使在轴突存在的情况下，Raf/ERK信号依然能够诱导细胞去分化［1］。同样在体外将无胸腺的野生型裸鼠的胚胎上皮和成年兔的角膜中心上皮进行结合，在相关的胚胎毛囊发育信号Wnts的控制下，已分化定型的成年兔角膜上皮基底细胞发生去分化，还原成边缘性基底细胞表型。最初的过程包含Pax6的下调以及角膜特异性蛋白表达和基底角化细胞标记诱导的缺失。这些去分化的细胞通过Noggin依耐性机制，能够再刺激真皮浓集区，接着诱导Pax6表达缺失的细胞形成毛囊滤泡。随后，由新近分离的毛囊干细胞衍生的细胞分化形成表皮［5］。逆转素reversine是一种2，6二甲基嘌呤衍生物，于2004年首次被发现能够诱导小鼠定向分化的肌源性C2C12细胞去分化形成多能祖细胞，并能够分化形成骨细胞和脂肪细胞。之后又陆续发现该化合物能够诱导多种肿瘤细胞出现周期停滞、多倍体和细胞凋亡，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，最终导致其死亡［6－7］，而其对于正常细胞的影响相对较小［8］;在50 nmol/L 的低浓度下，reversine显著提高人类骨髓间充脂肪干细胞和脂肪组织干细胞的分化率［9］;reversine还能够使包括影响细胞间相互作用、细胞运动、细胞生长发育的很多基因表达发生显著改变，增强成熟Wistar大鼠纤维化细胞的可塑性，促进其去分化形成骨祖细胞样细胞［10］。最近研究将骨髓间充质干细胞来源的神经细胞去除神经细胞诱导剂，换用含血清培养液可以去分化成较原始的细胞群，称为去分化的骨髓间充质干细胞。这种去分化的细胞保留了干细胞的特征，但与原始骨髓间充质干细胞相比，去分化的骨髓间充质干细胞在体外能改善细胞存活并提高神经元分化潜能;在大鼠脑损伤模型中，这种去分化的骨髓间充质干细胞能明显改善认知功能［11］。分离提纯大鼠心肌细胞，培养数天以后发现，纯化的心肌细胞失去他们特有的电生理学的性质和纹理，变得扁平并开始分开。很多去分化的心肌细胞开始表达干细胞抗原c-kit，早期心脏转录因子GATA4和Nkx2.5;部分心肌细胞来源的细胞在体外自发形成球形，并能够再分化形成心肌细胞和内皮细胞［11］。

3 细胞去分化的可能机制

细胞在接受外界相应刺激的情况下发生去分化，该过程可能涉及细胞基因表达、细胞内环境、细胞内信号传导以及细胞表型的改变。如果其中某个环节被中断，去分化过程将受阻。去分化的发生往往是在某些特定生物学刺激下发生的，这些刺激在细胞中被转化为生物学信号，进而引导细胞逐步发生去分化。

体外培养的兔肾近端小管细胞，在遭受部分细胞氧化剂损伤死亡后，表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体、P38、Scr和促细胞分裂剂激活性蛋白激酶3(mitogen activated protein kinase kinase 3，MKK3)被活化，最终存活的细胞发生去分化;其去分化机制可能包括:P38调节EGF受体的活化;Scr激活MKK3;MKK3逆向活化P38，最终由EGF受体来参与调节肾近端小管细胞的去分化，特异性抑制剂抑制EGF受体或P38后可阻断肾近端小管细胞去分化［11］。另一项研究将无胸腺的野生型裸鼠的胚胎上皮和成年兔的角膜中心上皮结合1～2 d后，在真皮发育信号的诱导下，去分化的上皮细胞中的β-连接蛋白、Lef-1和K17明显增加。角膜上皮去分化形成的细胞能够分化得到滤泡间上皮，但去分化的发生不单纯是简单的细胞结合;真皮中Noggin的表达对于角膜角蛋白细胞最初的分化并非是必须的，而对于毛发的形成以及K10阳性细胞的出现是必不可少的［11］。采用reversine诱导成肌细胞去分化发现，reversine可能阻断非肌源性肌球蛋白重链Ⅱ和丝裂原活化蛋白激酶1，继而改变细胞周期及组蛋白乙酰化状态，最终使细胞发生去分化改变［12］。最近在叶酸诱导的小鼠急性肾损伤模型的研究中发现，EGF受体活性对于肾小管细胞去分化和增生是必不可少的［13］。

4 细胞去分化研究面临的问题

一方面，通过细胞的去分化可以获得多种细胞类型，去分化得到的多潜能细胞，可以用来修复异常或者受损害的组织。另一方面，细胞去分化的研究涉及各种细胞，但是尚未找到一种能够稳定高效去分化的细胞。诱导细胞去分化的方法根据细胞类型各不相同，缺乏统一可靠的诱导体系。由于细胞去分化的详细机制尚未明确，通过去分化获得的细胞的细胞特性也不确定，其基因类型、细胞表型以及分化能力等均需要深入探索。

通过反转录病毒将4个转录子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)转染至小鼠皮肤成纤维细胞后，发现成熟细胞可重编程为胚胎干细胞样细胞，称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)，它可以再分化成神经细胞或肌细胞，但该技术费用高、转化效率低且存在致瘤性等缺点，限制了其实用性［13］。而通过质粒将基因导入脐带血细胞，一旦进入细胞，质粒就会触动细胞向原始状态转化，血细胞转化为 iPS细胞的成功率高达50% ～60%［13］。采用化学分子诱导成熟细胞去分化为诱导多能干细胞具有一定优势。比如药物可快速高效到达靶细胞;操作简便、便于推广，但目前尚未发现稳定高效且作用确切的特定诱导化学分子。

将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因转到一蝾螈能再生的细胞内，对另一没有GFP基因的蝾螈进行截肢术，随后将带有GFP基因蝾螈的细胞移植到另一没有GFP基因的蝾螈断肢上，通过荧光观察蝾螈再生的过程发现:皮肤细胞能够再生为皮肤细胞、结缔组织和肌腱，而软骨细胞、肌肉细胞和施旺细胞各自再生形成原来的细胞类型［14］。上述实验结果表明，细胞再生的过程并非成熟的细胞都发生去分化，变成干细胞样细胞，再统一分化，细胞去分化所能达到的幼稚程度有待进一步研究，并且成体细胞去分化后的再生是否具有定向分化的特点有待确定。

5 细胞去分化用于细胞治疗的前景与展望

衰老、疾病及意外等造成人体细胞的老化、坏死，去分化为我们获得理想的移植细胞提供一种新的来源，为疾病治疗带来了一种新的策略。现有的去分化研究已经涉及各个细胞领域。在衰老修复方面，reversine能够诱导骨祖细胞样细胞的产生，可用于椎间盘的修复［10］。在病因研究方面，EGF可以诱导人类胰岛细胞去分化，应用于胰岛细胞相关疾病研究［15］;正常的甲状腺组织能够在一个培养固定的培养体系中去分化形成多功能的祖细胞，该培养体系可以用来阐明甲状腺疾病的机制［16］;非干细胞在一定炎性因素的刺激下可发生去分化而获得肿瘤触发作用，有利于对肿瘤发生机制的深入研究［17］。在疾病治疗方面，皮肤纤维原细胞诱导为与人体运动神经细胞功能相似的细胞，具备治疗神经损伤及退行性病变的可能性［18］。成人骨髓和外周循环血液中提取的血细胞通过质粒转导基因后可去分化成相对原始的干细胞，有望用于治疗血液系统疾病［19］。胰腺β细胞在病理情况下发生去分化与2型糖尿病关系密切，有望通过对去分化β细胞进行再分化来治疗2型糖尿病［20］。

今后的去分化研究将兼顾哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞，观察在自然状态下和人为干预后发生的去分化，从细胞层面、分子层面揭示去分化的机制，并通过组织层面、功能层面来检验去分化的作用。另外，单一的去分化作用有限，需要与转分化、重编程等相结合，来更好地实现基础医学研究向临床医学应用转化［21］。

通过去分化途径获得理想的移植细胞后经过再分化和转分化等处理，并最终用于细胞组织损伤的再生修复，将会给创伤医学、肿瘤医学、康复医学、组织工程学等带来深远影响。

［1］ Harrisingh MC，Perez-Nadales E，Parkinson DB，et al．The Ras/Raf/ERK signalling pathway drives Schwann cell dedifferentiation［J］．EMBO J，2004，23:3061 － 3071．

［2］Li H，Fu X，Zhang L，et al．In vivo dedifferentiation of human epidermal cells［J］．Cell Biol Int，2007，31:1436 －1441．

［3］Porrello ER，Mahmoud AI，Simpson E，et al．Transient regenerative potential of the neonatalmouse heart［J］．Science，2011，331:1078－1080．

［4］Cobaleda C，Jochum W，Busslinger M．Conversion ofmature B cells into T cells by dedifferentiation to uncommitted progenitors［J］．Nature，2007，449:473 －477．

［5］Pearton DJ，Yang Y，Dhouailly D．Transdifferentiation of corneal epithelium into epidermis occurs bymeans of amultistep process triggered by dermal developmental signals［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2005，102:3714－3719．

［6］Kuo CH，Lu YC，Tseng YS，et al．Reversine induces cell cycle arrest，polyploidy，and apoptosis in human breast cancer cells［J］．Breast Cancer，2012．doi:10．1007/s12282-012-0400-z．

［7］Hua SC，Chang TC，Chen HR，et al．Reversine，a 2，6-disubstituted purine，as an anti-cancer agent in differentiated and undifferentiated thyroid cancer cells［J］．Pharm Res，2012，29:1990 －2005．

［8］Piccoli M，Palazzolo G，Conforti E，et al．The synthetic purine reversine selectively induces cell death of cancer cells［J］．JCell Biochem，2012，113:3207 －3217．

［9］Conforti E，Arrigoni E，PiccoliM，etal．Reversine increases multipotent human mesenchymal cells differentiation potential［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2011，25:S25－S33．

［10］Saraiya M，Nasser R，Zeng Y，et al．Reversine enhances generation of progenitor-like cells by dedifferentiation of annulus fibrosus cells［J］．Tissue Eng Part A，2010，16:1443－1455．

［11］Zhang Y，Li TS，Lee ST，etal．Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes［J］．PLoS One，2010，5:e12559．

［12］Chen S，Zhang Q，Wu X，et al．Dedifferentiation of lineage-committed cells by a smallmolecule［J］．JAm Chem Soc，2004，126:410－411．

［13］He S，Liu N，Bayliss G，et al．EGFR activity is required for renal tubular cell dedifferentiation and proliferation in a murinemodel of folic acid-induced acute kidney injury［J］．Am JPhysiol Renal Physiol，2013，304:F356 － F366．

［14］Kragl M，Knapp D，Nacu E，et al．Cells keep amemory of their tissue origin during axolotl limb regeneration［J］．Nature，2009，460:60－65．

［15］Hanley SC，Assouline-Thomas B，Makhlin J，et al．Epidermal growth factor induces adult human islet cell dedifferentiation［J］．JEndocrinol，2011，211:231 －239．

［16］Suzuki K，Mitsutake N，Saenko V，et al．Dedifferentiation of human primary thyrocytes intomultilineage progenitor cellswithout gene introduction［J］．PLoSOne，2011，6:e19354．

［17］Schwitalla S，Fingerle AA，Cammareri P，et al．Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties［J］． Cell，2013，152:25－38．

［18］Karumbayaram S，Novitch BG，Patterson M，et al．Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells generates active motor neurons［J］．Stem Cells，2009，27:806－811．

［19］Park TS，Huo JS，Peters A，etal．Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors［J］．PLoSOne，2012，7:e42838．

［20］Dor Y，Glaser B．Beta-cell dedifferentiation and type 2 diabetes［J］．N Engl JMed，2013，368:572 －573．

［21］Eguizabal C，Montserrat N，Veiga A，et al．Dedifferentiation，transdifferentiation，and reprogramming:future directions in regenerativemedicine［J］．Semin Reprod Med，2013，31:82－94．