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HPLC法测定獐芽菜苦苷含量及有关物质

2014-04-09李大亮吕文博

关键词:试品杂质供试

李大亮 张 辉 吕文博

(1.黑龙江生态工程职业学院,黑龙江 哈尔滨150025;2.哈尔滨药业股份有限公司,黑龙江 哈尔滨 150025)

HPLC法测定獐芽菜苦苷含量及有关物质

李大亮1张 辉2吕文博1

(1.黑龙江生态工程职业学院,黑龙江 哈尔滨150025;2.哈尔滨药业股份有限公司,黑龙江 哈尔滨 150025)

目的:为更好地控制产品质量,建立獐芽菜苦苷含量及有关物质检查方法。方法:采用高效液相色谱法,有关物质检查方法进行专属性、溶液稳定性及检测限方法验证,采用含量测定方法进行溶液稳定性、线性、准确度、精密度、重复性方法验证试验。结果:方法验证结果表明所建立方法可行。结论:所建立方法可有效控制产品质量。

HPLC法;獐芽菜;苦苷;含量;有关物质;方法验证

獐芽菜苦苷为獐芽菜中主要成分,因其药理作用广泛,越来越受到人们关注,市场上出现以獐芽菜苦苷为主要成分的制剂,如何控制獐芽菜苦苷制剂产品质量,显得尤为重要。通过相关研究建立獐芽菜苦苷含量及有关物质检查方法。

1 材料与仪器

獐芽菜苦苷对照品 来源:哈尔滨药业股份有限公司

Agilent 1260高效液相色谱仪 厂家:安捷伦科技有限公司

色谱柱:Venusil XBP C18 4.6*250mm,5μm 厂家:天津博纳艾杰尔科技有限公司

2 有关物质检查

2.1 有关物质检查方法筛选

参照相关文献[1,2],对獐芽菜苦苷有关物质检查方法进行筛选,流动相选择甲醇及水进行筛选,根据杂质分离情况,确定流动相比例,同时进行相关方法验证。

2.2 耐用性试验

通过对不同厂家的色谱柱进行筛选,结果Venusil XBP C18对杂质分离最好,当甲醇∶水为30∶70时,各杂质峰与主峰可有效分离。变换柱温,改变流速,改变流动相比例,考察杂质检出情况,结果改变柱温、流速、流动相比例,杂质与主峰分离度符合规定,杂质检出量基本一致。

2.3 溶液稳定性试验

取獐芽菜苦苷原料,加流动相制成0.25mg/ml溶液,分别于0、2、4、6、8h测定。结果供试品溶液在4h时杂质增加较明显,供试品溶液配制后在4h内进样。

2.4 检测限

取獐芽菜苦苷对照品,制成不同浓度溶液,进样,以信噪比约为3∶1为检测限。结果本品检测限溶液浓度为27ng/ml(信噪比为2.8),供试品浓度与检测限浓度比值约为8 000,溶液浓度可行。

2.5 专属性

考察供样品在酸、碱、氧化、高温及强光条件下稳定性,DAD检测器全波长监测,为确定检测波长提供依据,评价在各条件下稳定性及可能降解产物。结果獐芽菜苦苷样品破坏前后峰纯度均符合规定(DAD监测),说明主峰与杂质峰可有效分离。各波长监测结果表明在230nm波长处为最佳检测波长。

2.6 已知杂质研究

专属性试验中发现有一杂质超过0.1%,初步分析该杂质为獐芽菜苷,取獐芽菜苷对照品进样,结果表明该杂质为獐芽菜苷。分别取獐芽菜苦苷及獐芽菜苷对照品,配制不同浓度溶液5份,分别进样,根据标准曲线斜率之比,计算二者相对响应因子,结果獐芽菜苷与獐芽菜苦苷相对响应因子为0.73。

2.7 有关物质检查

色谱条件与系统适用性实验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Venusil XBP C18);以甲醇—水(30∶70)为流动相;检测波长为230nm。理论板数按獐芽菜苦苷峰计算应不低于5 000。取供试品加流动相制成0.25mg/ml溶液,作为供试品溶液,精密量取供试品溶液1ml于100ml,加流动相至刻度,作为对照溶液。取供试品及对照溶液进样,獐芽菜苷不得过0.5%,单一杂质不得过0.1%,总杂质不得过1.0%。

取供试品按照确定方法检查,结果獐芽菜苦苷为0.16%,单一未知杂质0.03%,总杂质0.31%。峰纯度监测符合规定。所建立有关物质检查方法可行,可以有效控制产品质量。

3 含量测定

3.1 方法及色谱柱

供试品溶液浓度及流动相与有关物质检查方法相同,色谱柱Venusil XBP C18 4.6*250mm,5μm,厂家:天津博纳艾杰尔科技有限公司。

3.2 系统适用性试验

取獐芽菜苦苷对照品加流动相溶解制成0.25mg/ml溶液作为对照品溶液,精密量取对照品溶液10μl,重复进样6次。结果重复进样6次,主峰相对标准偏差为0.2%,保留时间相对标准偏差为0.5%,符合规定。

3.3 耐用性试验

取对照品及供试品,按照拟建立方法通过改变流动相比例、流动相pH值、柱温、流速及更换色谱柱(相同品牌,不同批号)考察分析方法本身偏差的影响,结果各条件微小变化含量测定结果偏差均符合规定,同时各条件下分离度及对称因子均符合规定,塔板数较高,耐用性试验符合要求。

3.4 线性试验

精密称取獐芽菜苦苷对照品,制成不同浓度的溶液,分别测定其主峰的面积。以溶液浓度为横坐标(X),主峰峰面积为纵坐标(Y),结果线性试验符合要求。

3.5 溶液稳定性试验

取供试品加水制成0.25mg/ml的溶液,分别于0、1、2、3、4h测定溶液峰面积,溶液在4h含量下降约0.5%,供试品溶液比较稳定。

3.6 重复性试验

精密称取供试品,配制6份相同浓度溶液,进样,结果6份相同浓度样品测定结果的相对标准偏差为0.3%,符合要求。

3.7 中间精密度试验

在不同时间由不同分析人员使用不同仪器进行试验,精密称取供试品溶液,配制6份相同浓度溶液,进样,计算12次试验测定结果相对偏差,结果12次测定结果的相对标准偏差为0.6%,中间精密度符合规定。

3.8 准确度试验

配制浓度为80%、100%和120%的供试品溶液各三份,采用加入法测定回收率,分别测定其含量,将实测值与理论值比较,计算回收率。

对照品溶液制备:精密称取獐芽菜苦苷对照品2份,分别于25ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

供试品溶液制备:精密称取獐芽菜苦苷样品2份,分别于50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,测定供试品含量为99.3%。

供试品溶液Ⅰ制备(80%):分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中,加水稀释至刻度,平行制备3份。

供试品溶液Ⅱ制备(100%):分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中,加水稀释至刻度,平行制备3份。

供试品溶液Ⅲ制备(120%):分别精密称取獐芽菜苦苷供试品及獐芽菜苦苷对照品于25ml量瓶中,加水稀释至刻度,平行制备3份。

取上述溶液按照含量测定方法进行测定,计算回收率,结果平均回收率为99.3%、99.6%、100.1%,相对标准偏差为0.2%,准确度试验符合要求。系统适用性、耐用性、线性、重复性、溶液稳定性、中间精密度及准确度试验结果表明含量测定方法可行。

3.9 含量测定

取样品,按确定的含量测定方法测定,结果分别为99.8%、99.6%、99.4%。

4 结论

本文对獐芽菜苦苷有关物质及含量检查方法进行验证,方法学验证结果表明所建立方法可行,并对样品中已知杂质进行研究,并制定合理限度,所建立方法可以有效控制产品质量。

[1]贾珍,杨凤梅.高效液相色谱法测定藏茵陈注射液中獐芽菜苦苷的含量[J].中国现代应用药学,2007,24(5):392~393.

[2]包同力嘎.HPLC法测定不同产地肋柱花中獐芽菜苦苷的含量[J].辽宁中医杂志,2013,40(12):2 558~2 559.

责任编辑:桑咏梅

10.3969/j.issn.1674-6341.2014.04.011

2014-05-08

李大亮(1981-),男,黑龙江哈尔滨人,讲师,硕士。研究方向:中药有效成分提取与分离。

R927.2

A

1674-6341(2014)04-0023-02

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