张克山，何继军，吴佳俊，刘永杰，成伟伟，尚佑军，刘湘涛，才学鹏

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄动物的一种烈性传染病[1]，FMDV包含7个血清型，其作为一类动物传染病，给我国畜牧业健康发展和人们身体健康造成巨大威胁[2]。FMDV除引起偶蹄动物蹄、唇部水泡外还可引起幼畜的急性死亡，其致哺乳幼畜死亡的最主要原因是急性心肌炎，FMDV感染幼畜心脏致使心肌变性、坏死而出现灰白色或淡灰色斑点和条纹(又称虎斑心)，多不表现出FMD特有的临床症状而急性死亡[3]。在兽医临床上常见哺乳仔猪因FMDV感染导致急性心肌炎而大批死亡[4]。近年来育肥猪(或牛)因感染FMDV导致心肌炎而出现的急性死亡病例有迅速抬头之势, FMDV引起羔羊心肌炎而急性死亡也曾有报道[5]。乳鼠作为对FMDV较为敏感的动物，常被用来FMDV的分离培养、血清型鉴定和毒力测定[6-8]。目前对于FMDV引起心肌炎分子机制的研究越来越受到重视，研究发现肌钙蛋白Ⅰ在羊血清中可作为FMDV引起心肌炎的生物标志[9]。动物模型的建立是FMDV致心肌炎研究中最重要也是最基础的一个环节，但目前还没有很好的用来研究FMDV心肌炎的动物模型。本文建立了FMDV感染乳鼠心肌炎动物模型，为FMDV致心肌炎分子机制的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1乳鼠及病毒接种 3日龄SPF BALB/c乳鼠12只，随机分成两组，6只/组，乳鼠和母鼠一同饲养。A型FMDV病毒来源于国家口蹄疫参考实验室细胞适应毒，其毒价TCID50为106.5，实验组6只乳鼠全部颈部皮下注射含有105.5TCID50A型FMDV的PBS 100 μL，对照组6只乳鼠全部颈部皮下接种PBS 100 μL。连续观察36 h，取频临死亡的实验组乳鼠和同一时间的对照组乳鼠心脏，剪开用灭菌PBS冲洗干净后，同一乳鼠心脏一分为二分别浸泡于甲醛和戊二醛溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2乳鼠心脏H.E染色观察 实验组和对照组乳鼠心脏经甲醛固定后切割成薄片, 经常规苏木精-伊红(H.E)染色封片后显微镜下观察变化。

1.3乳鼠心肌透射电镜显微观察 实验组和对照组乳鼠心脏浸泡于用PBS配置成的3%的戊二醛溶液中，经过4 ℃固定、预处理、包埋和切片后放置于JEM-400cx透射电镜下观察显微结构变化。

1.4乳鼠心肌内FMDV特异性基因扩增 参考GenBank公布的FMDV基因序列(JF792355.1)，设计引物扩增FMDV VP1基因，上游引物5′- GGC AAG GAC TTT GAG TT，下游引物5′- GCG GTC TTG TGT GGT GTC - 3′ 。分别取实验组和对照组乳鼠心肌1～3 g，加入适量PBS研磨成10%的悬液, 5 000 r/min离心10 min后取上清，RNA快速提取试剂盒提取总RNA，RT-PCR反应体系为：RNase Free ddH2O 15 μL，10×RT buffer 5 μL，MgCl210 μL，dNTPs(10 mmol/L) 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL) 1 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，Template RNA 10 μL。反应条件为：50 ℃ 35 min；99 ℃ 5 min；进入PCR程序为94 ℃变性30 s 56.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min共计35个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min。扩增结束取RT-PCR反应液5～10 μL，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定分析。

2 结 果

2.1接种FMDV后乳鼠观察 FMDV攻毒后36 h,接种PBS对照组的乳鼠皮肤红润，反应灵敏，精神状态良好(图1A)，而感染组乳鼠皮肤暗淡无光，反应迟钝，四肢僵硬，频临死亡(图1B)。

图1FMDV接种后乳鼠观察

Fig.1ObservationofsucklingmiceafterFMDVinfection

A: Mouse in negative control group; B: Mouse in experimental group.

2.2乳鼠心肌H.E染色观察 实验组乳鼠接种FMDV后36 h H.E染色可见心肌纤维水肿且纤维结构不完整，间质充血，中性粒细胞及单核细胞浸润(图2A)，而对照组乳鼠心肌纤维完整，间质、血管等结构均正常清晰(图2B)。

2.3乳鼠心肌电镜观察 经透射电镜观察可见对照组乳鼠心肌纤维结构清晰，肌纤维排列整齐，肌节结构正常(图3A)，感染组接种FMDV后36 h可见大量心肌细胞线粒体肿胀，心肌纤维溶解，肌纤维结构不完整(图3B)。

2.4目的基因扩增 感染组6只乳鼠，每只乳鼠心肌中均可扩增出FMDV 特异性目的基因VP1(图4 Lane 1-6)，而对照组未扩增出FMDV特异性目的基因(图4 Lane 7)。扩增出的目的基因经序列测定分析，为FMDV特有的VP1基因序列。

图2FMDV感染后乳鼠心肌病理切片H.E染色(400×)

Fig.2PathologicsliceofsucklingmicecardiacmusclebyH&Estain(400×)

A: Myocardium of mice in experimental group;

B: Myocardium of mice in negative control group.

图3FMDV感染后乳鼠心肌透射电镜观察(6000×)

Fig.3ObservationofsucklingmicecardiacmuscleunderTEM(6000×)

A:Myocardium of mice in negative control group; B: Myocardium of mice in experimental group.

图4乳鼠心肌中FMDVVP1基因扩增

Fig.4Geneamplificationfromsucklingmicecardiacmuscle

1-6: FMDV detection from myocardium of mice in experimental group; 7: FMDV detection from myocardium of mice in control group; M: DNA ladder 2000.

3 讨 论

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌间质和(或)实质的弥漫性或局限性病变，表现为心肌细胞损伤，心肌细胞变性[10]和心肌纤维之间和血管周围结缔组织中大量炎性细胞浸润。人们对口蹄疫的关注往往局限于唇部水泡或者蹄冠部水泡或者坡行[11]，很少关注该病毒引起的心肌炎。实际生产中常见FMDV感染致哺乳幼龄动物死亡或者出现青壮年动物死亡的病例，这主要是FMDV感染引起急性心肌炎的结果。目前已知的心肌炎发病机制有基因表达调控，免疫反应[12]，病毒直接作用，心肌纤维化，心肌能量代谢障碍和细胞凋亡等。感染初期可见病毒引起的心肌细胞溶解，伴有体液和细胞免疫反应。自身反应性T淋巴细胞破坏未感染的心肌细胞，造成严重的心肌损害[13]，病毒特异性细胞毒T淋巴细胞引起被感染的心肌纤维溶解。

本文以3日龄乳鼠为研究对象，接种FMDV后观察其死亡和心肌炎表现，经H.E染色和透射电镜观察，看到明显的FMDV感染组乳鼠心肌出现严重的炎症反应和心肌纤维溶解，感染组乳鼠心肌内检测到FMDV的存在，进一步证实了该变化是由FMDV感染引起的。为安全起见，本试验所有操作均在国家口蹄疫参考实验室P3实验室内完成。该动物模型的建立为进一步研究FMDV致动物心肌炎的分子机制奠定了基础,下一步的工作将是寻找FMDV感染后炎性心肌细胞和正常心肌细胞之间的蛋白质组学差异，鉴定、分析并验证这些差异蛋白在乳鼠心肌炎发病过程中所扮演的角色。

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