刘晔华(综述)，穆 红(审校)

(天津市第一中心医院检验科，天津 300192)

1959年，甲氧西林用于治疗青霉素耐药的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染。1961年，在英国即分离到耐甲氧西林的MRSA，随后欧洲其他国家也分离出MRSA，之后在日本、澳大利亚和美国分离出该菌。目前MRSA正在全世界快速蔓延，所致感染可呈散发、流行、甚至暴发[1-2]。MRSA的感染已成为全球公共卫生问题之一。

迄今为止，已对MRSA进行了从表型分析(比如噬菌体分型)到基因组分型——脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)的一系列研究[3]，最近基于单个基因或基因联合运用的分型技术有很大发展，该技术的优点在于通过基因分型所建立的数据库具有在不同实验室间的可比性，通过公用网站对所得数据资料归纳汇总，对暴发流行株进行亲缘鉴定和克隆群区分，以发现新的型别。

1 MRSA的基因组构成

MRSA的基因组可分为核心基因和附属基因两个部分，其核心基因主要包括7个看家基因(arcC、aroE、glpE、gmk、pta、tpi、yqiL)，这些基因进化相对缓慢，主要通过点突变和基因置换完成进化，因此相对稳定。多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的方法是基于上述450～500 bp的7个看家基因的等位基因不同型别的分子分型技术[4]，这种方法可在全球范围内对MRSA进行克隆群体的区分，以便进一步对所调查的菌株溯源。MRSA的附属基因包括mecA毒力因子(sea、tst和eta等)和黏附基因家族成员(clfA、clfB、fnbA、fnbB、spa等)[5]，这类基因可在菌株间传递，其所编码蛋白与细菌的表型相关(图1)。总体上说，MLST分型可以了解特定地区MRSA的群体结构，即哪个克隆群占优势；基于附属基因的分型方法更适合特定地区MRSA的流行病学监测，但两类方法需联合运用以互补。

图1 金黄色葡萄球菌基因结构图

2 MRSA的分型方法

2.1spa基因分型 MRSA spa基因序列全长1527 bp，是编码509个氨基酸的A蛋白，该蛋白是MRSA细胞壁的组成部分。spa基因从5′端到3′端依次为信号序列S、IgG结合区域A～D(E区域和A～D同源)、X可变重复区域(图2)，其中Xr区由24 bp重复序列串联组成，点突变形成了重复序列的多个型别，而重复序列的插入或缺失构成了Xr区长度以及串联图谱的多态性，到目前为止spa的重复序列已达581个[6]，这可以确保该分型方法的灵敏度和分型能力。在X区域上游的C末端存在高度保守性的开放读码框，可对X区域进行聚合酶链反应以便对不同菌株进行基因分型，已经有公共网站进行分型比对(http://spa.ridom.de/spaserver)。

图2 spa的基因结构(从左到右5′～3′)

最早应用spa分型技术的是Frénay等[7]，他们以14株已公布全基因组序列的MRSA作为对照，测定了33株MRSA spa基因X区串联重复序列，认为流行株X区串联重复序列相对较长，这有助于细菌与IgG的Fc段结合。随后Shopsin等[8]从散发流行到暴发流行的角度对spa分型技术进行了全面评价，并公布了spa重复序列的型别以及编码方式，使得该技术得到进一步应用。2003年Harmsen等[9]研发了spa分型软件并创建了公共网站，通过上传各地区MRSA spa的串联重复序列测序结果，即可得到相应型别；随后该网站完善了对MRSA的spa型别归纳汇总，类似对MLST分型结果进行CC克隆群体的亲缘鉴定，同时该网站可以将spa的分型结果与MLST分型结果进行对应，弥补了单一分型方法的局限性(http://spa.ridom.de/mlst.shtml)。大量的研究报道指出，spa分型技术不如PFGE敏感，但优于MLST的分型能力[10-13]。因此，应对区域性MRSA的暴发流行调查或短期内该菌的流行病学调查，spa分型是一种简单易行的方法[14-16]。

2.2clfB基因分型 clfB基因与spa基因相似，MRSA的clfB是黏附素基因家族成员之一[17]，由其编码的凝集因子B可锚定于人类纤维蛋白和角蛋白上，继而使MRSA定植于人类鼻咽部，因此clfB在MRSA的致病机制中发挥着重要作用。有报道称，clfB在MRSA所致的心内膜炎中发挥病理作用[18]。clfB基因含有420～804 bp的丝氨酸-天冬氨酸(serine-aspartate，SD)高度变异串联重复序列，该SD序列由18 bp(TCN-GAY-TCN-GAY-AGY-GAY，其中N=A、C、G或T、Y=C或者T)组成(图3)，由于核苷酸突变以及发生于复制阶段的链错配致使SD序列增加或丢失，使得该区域具有遗传多态性。clfB具有体内、外稳定性及宿主之间传播的稳定性，且clfB为毒力基因，易受进化选择压力的影响，加之SD序列的高度变异性保证了clfB分型的高分辨率，因此可以作为MRSA分型的候选基因[17,19]。已知clfB的SD序列有102个不同的型别，依据应用spa串联重复序列分型的原理，也可应用clfB的SD序列对MRSA进行分型。依据该基因的病理作用，将有助于区分感染株和定植菌株。

最早应用clfB进行分型的报道来自美国新泽西医学院的Koreen等[19]的研究组和洛克菲勒大学Gomes等[20]的研究组对MRSA所做的clfB分型，结果显示其分型能力仅次于PFGE，优于spa和MLst的分型能力，而且与PFGE和spa分型的一致性>95%。

图3 clfB的基因结构

Ugolotti等[21]研究人员在Koreen等[19]的基础上对clfB分型方法做了改进，相应法则如下：如果clfB重复序列的图谱具有相同的5′和3′端，则归入同一系列，同一系列内的亚类通过罚分法则区分，其中插入、不连续缺失以及18 bp重复序列被12 bp序列置换各有相应罚分，最终累计分数可区分不同亚类：1=A<2；2=B<3；3=C<4；4=D<5；5=E<6；6=F<7；7=G<9；9=H<11；L>=11。不同的系列用不同罗马数字表示。

2.3spa-clfB双位点基因分型 研究认为，单纯应用spa分型、clfB分型不及PFGE的分型能力，但PFGE对同一菌株在体外传代或保存几个月后再进行分型，其结果即可能改变[17,22]，加之PFGE操作费时，至今尚未建立针对其分型的一致判别标准，故该方法不能在不同实验室间进行比对。Kuhn等[10]将spa与clfB联合应用，即双位点序列分型(double-locus sequence typing，DLST)，这既分析了spa和clfB全部重复序列的图谱，也分析两者自3′端500 bp重复序列图谱。联合分型的分型能力与PFGE相当，且更加经济省时。许多专家研究证实，spa和clfB这两个候选基因具有体内外稳定性强，不易发生遗传突变的特点[6,19]。Basset等[23]的研究组应用DLST分型技术对186株甲氧西林敏感MRSA和103株MRSA进行分型，获得了205个DLST基因型，分型指数(index of discrimination,ID)为0.994。Ugolotti等[21]应用DLST技术对一家医院的ICU、外科和急诊科室进行了3年的流行病学调查，查明了几个科室MRSA的主要流行株，与PFGE相比，DLST简便、重复性好，ID达到0.85，优于spa(ID=0.58)和clfB(ID=0.83)。

3 小 结

MRSA基因组可分为核心基因和附属基因两部分，基于核心基因的分型包括MLST分型，基于附属基因的分型包括spa分型、clfB分型以及spa-clfB双位点基因分型等。MLST分型可了解特定地区MRSA的群体结构，即哪个克隆群占优势；spa分型、clfB分型及spa-clfB双位点基因分型更适合特定地区MRSA的流行病学监测。简而言之，对于MRSA的分型，不论是PFGE、MLST，还是依据于附属基因(如spa、clfB分型等)的可变串联序列分型，任何一种方法的分型能力都存在局限性，因此需联合应用几种分型方法，并结合流行病学资料，才能做到准确溯源。

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