欧阳乐军，梁卓玲，黄真池，沙月娥，曾富华

(湛江师范学院 生命科学与技术学院,广东 湛江 524048)

研究表明，细菌间通过群体感应(Quorum sensing，QS)系统实现信息交流，调控群体行为[1]。许多致病菌的QS系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)为信号分子，据此人们试图从植物或微生物中发现能编码降解AHLs酶的基因，通过转基因技术培育产生可降解AHLs的转基因植物，破坏病原菌信号分子，从而猝灭植物病原菌的群体感应系统。研究表明，这种方法可有效减弱病原细菌致病力，提高植物的抗病能力[2]。病原菌群体猝灭基因(aiiA基因)表达产物为N-酰基高丝氨酸内酯酶(AHL-Lactonase)，是一种具有降解AHLs分子能力的特异性水解酶。AHL-Lactonase通过水解AHLs分子的内酯键，可降低致病菌群中信号分子的活性，从而极大地减弱致病菌的危害能力[3]。通过构建基因的原核表达载体，将外源基因在原核生物中表达后，提取其表达产物，从而进一步鉴定其功能是目前基因功能研究常用的方法，但原核表达条件需不断优化，以提高表达量。欧阳乐军等[4]在前期研究工作中，成功地从枯草芽孢杆菌亚种Bs-6菌株中克隆得到aiiA基因，其序列与已报道aiiA的同源性为87%～96%，并通过基因工程方法构建了克隆载体pMDTM19-T Vector+aiiA。在此基础上，本研究将pMDTM19-T Vector+aiiA的aiiA基因双酶切回收后，与经同样双酶切的pGEX-4T-1相连，构建其原核表达载体，进行诱导表达，并检测了表达产物的抑菌能力以及对病原菌致病力的影响，以期为利用基因工程手段培育转aiiA基因植株以猝灭植物病原菌的QS系统，增加植物抗病能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

pMDTM19-T Vector+aiiA、原核表达质粒pGEX-4T-1及青枯菌(R.solanacearum)、焦枯菌(C.quinqueseptatun)和桃色欧文氏杆菌由湛江师范学院植物工程中心实验室保存；E.coliBL21购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA Ladder Marker、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4-DNA ligase购自大连宝生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂，购自广州化学试剂厂。

1.2 方 法

1.2.1aiiA基因的获取 采用生工生物工程(上海)有限公司质粒纯化试剂盒提取纯化pMDTM19-T Vector+aiiA质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ对纯化的pMDTM19-T Vector+aiiA进行双酶切，酶切体系如下：10×K Buffer 8.0 μL，BamHⅠ(10 U/μL)3.0 μL，XhoⅠ(10 U/μL)3.0 μL，pMDTM19-T Vector+aiiA 6.0 μL，补充灭菌去离子水至30 μL。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并用生工生物工程(上海)公司琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒回收aiiA基因目的片段，具体方法按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.2 pGEX-4T-1+aiiA原核表达载体的构建及检验 采用生工生物工程(上海)有限公司质粒纯化试剂盒提取纯化pGEX-4T-1质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ对纯化的pGEX-4T-1质粒进行双酶切后，再用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并用生工生物工程(上海)公司琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒回收酶切大片段。按宝生物工程(大连)有限公司T4-DNA ligase操作说明，将1.2.1中经过BamHⅠ 和XhoⅠ双酶切的aiiA基因连接到经过同样双酶切的原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ与XhoⅠ酶切位点间，构建原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA。连接体系如下：T4-DNA ligase Buffer 4.0 μL，pGEX-4T-1 2.0 μL，纯化回收的aiiA片段6.0 μL，T4-DNA ligase (3 U/μL) 1.0 μL，补充灭菌去离子水至20 μL。混匀后置16 ℃连接12 h以上。取5 μL连接产物，用热激法转化E.coliBL21感受态细胞，具体方法参照E.coliBL21感受态细胞转化说明书进行。

采用QIAGEN公司的质粒纯化试剂盒提取pGEX-4T-1+aiiA质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切验证，具体酶切体系如下：10×K Buffer 8.0 μL，BamHⅠ(10 U/μL)3.0 μL，XhoⅠ(10 U/μL) 3.0 μL，pGEX-4T-1-aiiA 6.0 μL，补充灭菌去离子水至30 μL。将上述酶切体系各组分轻微离心混匀后，37 ℃酶切4 h以上。酶切结束后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

aiiA基因PCR检测引物由生工生物公司合成,Primer 1：5′-ATCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTCG-3′；Primer 2:5′-GTCCTCAACAAGATACTCCTAATGATGT-3′。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，模板(1 ng/μL)1.0 μL，上游引物(10 μmol/mL) 1.0 μL，下游引物(10 μmol/mL) 1.0 μL，PremixTaq酶(2 U/μL)0.5 μL, 补充灭菌去离子水至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。将酶切和PCR检测呈阳性的载体送往生工生物公司测序。

1.2.3 目的蛋白诱导表达条件的优化 取50 μL 1.2.2节中构建的含pGEX-4T-1+aiiA质粒的阳性重组菌，接种于5 mL LB培养液中，进行诱导表达培养。根据影响E.coli中可溶性靶蛋白表达量的因素，按表1设计L9(34)正交试验，优化影响可溶性靶蛋白表达量的因素。将诱导表达后的菌体用离心管收集后重悬于预冷的PBS溶液(含150 mmol/L NaCl、16 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L NaH2PO4，pH 7.3)中，用超声破碎法破碎菌体4 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清液进行SDS-PAGE检测。

表1 L9(34)正交试验设计表

1.2.4 aiiA蛋白对病原菌致病力的影响 将桃色欧文氏杆菌制成1×107CFU/mL菌悬液，与等量aiiA蛋白表达上清液混合接种消毒后的马铃薯片，用未接种桃色欧文氏杆菌、只单独接种桃色欧文氏杆菌以及接种桃色欧文氏杆菌+未诱导表达菌液的马铃薯片作为对照，将培养皿密封后置于25 ℃培养箱中培养2 d，观察马铃薯片的腐烂情况，并拍照记录结果。

将1.2.3节中9号试验的aiiA蛋白与青枯菌液混合后，以伤根接种法[5]接种尾巨桉，24 h后观察植株病症情况，以未加aiiA蛋白的青枯菌接种的尾巨桉为对照。

1.3 转aiiA基因植株的获得及抗性分析

利用农杆菌介导法将aiiA基因转入尾巨桉，选取分子检测[5]呈阳性的植株接种焦枯菌后，调查植株的抗性。植株病情指数计算参照方仲达[6]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 aiiA基因的获取

用BamHⅠ和XhoⅠ对纯化的pMDTM19-T Vector+aiiA进行双酶切后，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，得到与预期长度一致的2条条带，一条为目的基因aiiA，另一条为pMDTM19-T Vector大片段(图1)。回收aiiA基因片段，用于原核表达载体的构建。

2.2 aiiA基因原核表达载体的鉴定

提取重组质粒pGEX-4T-1+aiiA后，用PCR检测获得了与aiiA基因长度一致的条带(图2-A)，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果获得了与预期长度相一致的2条条带(图2-B)。同时，重组质粒pGEX-4T-1+aiiA测序结果证实，插入的外源目的基因序列与克隆载体中的aiiA基因序列一致。上述结果表明，原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。

图1 双酶切pMDTM19-T Vector+aiiA质粒获取的aiiA基因

图2 重组质粒pGEX-4T-1+aiiA的鉴定

2.3 pGEX-4T-1+aiiA诱导表达条件的优化

正交试验结果表明，温度是影响靶蛋白表达量的主要因素，当温度保持在37 ℃时，其他3个处理因素无论是否改变，都不影响靶蛋白的表达量，31 ℃时也出现相似的结果；而当诱导温度降至25 ℃时，靶蛋白的表达量最高，目的条带的位置与融合蛋白的分子质量54 ku (26 ku+27.5 ku)相当(图3)。

图3 重组aiiA蛋白原核诱导表达条件的优化

2.4 aiiA蛋白的抗病性测定

2.4.1 对桃色欧文氏杆菌致病力的影响 由图4可见，aiiA蛋白可以抑制桃色欧文氏杆菌对马铃薯的致病性，用aiiA蛋白上清液与桃色欧文氏杆菌一起接种后，马铃薯片腐烂程度明显减轻，说明aiiA蛋白对桃色欧文氏杆菌引起的腐烂有较好的抑制效果，而未添加aiiA蛋白的马铃薯片腐烂明显。

2.4.2 对青枯菌致病力的影响 尾巨桉接种青枯菌24 h后，对照植株表现出缺水迹象，植株萎蔫，叶片下垂，浇水不能减轻缺水症状；而接种青枯菌与aiiA蛋白混合液的尾巨桉植株形态正常，枝叶挺拔，无明显的感病症状(图5)，说明aiiA蛋白能有效降低青枯菌的致病力，延缓植株病症的发生。

图4 aiiA蛋白对桃色欧文氏杆菌致病力的影响

2.5 转aiiA基因尾巨桉植株对焦枯菌抗性的检测

尾巨桉接种焦枯菌3 d时，部分非转基因植株叶片出现病斑，呈烫伤状，少数叶片焦枯、皱缩、卷曲；枝条出现少数点状病斑(图6)；接种6 d时，非转基因植株病情指数达到19.3%，12 d时达到 67.3%，16 d时为97.6%(图7)。转aiiA基因植株接种3 d时未见异常(图6)，第6天时也未见异常，病情指数为0，接种16 d时病情指数为67.1%(图7)。根据病情指数的大小可判定，转aiiA基因尾巨桉较非转基因对照植株对焦枯菌的抗性明显提高。

图5 aiiA蛋白对青枯菌致病力的影响

图7 转aiiA基因植株接种焦枯菌后病情指数的变化

3 讨论与结论

随着群体感应与病原菌致病关系研究的不断深入，人们发现细菌自身诱导物AHLs是病原菌群体感应系统的主要信号分子，AHLs浓度降低时不能激活病原菌致病基因的表达[7-8]。随着此方面研究的深入，有望从植物或微生物中发现降解多种细菌群体感应信号分子的酶，根据植物对细菌QS系统的反应，通过转基因技术培育产生含AHLs降解酶的转基因植物，进而猝灭病菌的群体感应，提高植物抗病性[9-11]。笔者在前期的研究中，从Bs-6菌株中克隆了aiiA基因，并对其进行了生物信息学分析，在线BLAST分析时发现，Bs-6的aiiA基因与GenBank中已报道的aiiA基因同源性达87%～96%，且推导的氨基酸序列同源性为89.2%～98.4%，说明从Bs-6中成功克隆了aiiA基因，且该基因编码的AHL-Lactonase具有降解AHLs分子的性质，能够起到猝灭革兰氏阴性致病菌QS系统的作用。

原核生物表达系统中的E.coli表达系统具有高效性和稳定性[12]，因而运用最广泛，其遗传背景研究也最清楚。本研究应用的表达载体pGEX-4T-1含有谷胱甘肽S转移酶(GST)基因，能将外源基因表达为GST(分子质量为26 ku)的融合蛋白，以增加外源目的蛋白的可溶性。据以往的报道可知，本研究中正交试验设计的4个因素是影响E.coli中可溶性靶蛋白表达量的主要因素。其中诱导温度对可溶性靶蛋白的表达量影响最为显著；同时，诱导时间对可溶性靶蛋白的表达量也有很大的影响，随着诱导时间的延长，靶蛋白的表达量增加；适宜浓度的Amp能提供一定的选择压力，增强pGEX-4T-1质粒的稳定性，以提高可溶性靶蛋白的表达量。本试验结果表明，诱导温度是最主要的影响因素，这与以往的报道结果是一致的。这主要是由于较低的生长温度使蛋白质的合成速度降低，同时，无活性聚集体的形成速率也降低，这些聚集体是疏水性的，相互作用较弱，从而可减少包涵体的形成[13]。本试验对原核表达的条件进行了优化，提高了可溶性靶蛋白的表达量，避免对包涵体蛋白质进行变性与复性处理过程，为后续外源蛋白活性测定奠定了基础。

aiiA蛋白可以抑制桃色欧文氏杆菌对马铃薯的致病性，用aiiA蛋白上清液与致病菌一起接种后，马铃薯片的腐烂程度明显减轻，说明aiiA蛋白对桃色欧文氏杆菌引起的腐烂有较好的抑制效果，降低病菌的致病力。同时，aiiA蛋白与青枯菌混合接种尾巨桉后，因aiiA蛋白能有效降低青枯菌的致病力，植株病症的发生得到了延缓。利用病原菌信号分子群体猝灭机制以及植物抗病基因诱导表达策略，能显著增强抗病基因的表达效率，从而将病原菌信号分子猝灭，增强转基因植株的广谱抗性。本研究中，转aiiA基因尾巨桉接种焦枯病菌后，抗性水平比未转基因对照植株有明显提高，达到中等抗病水平。本研究结果对利用基因工程手段培育转aiiA基因植物，从而通过猝灭植物病原菌群体感应信号来破坏其QS系统，降低其致病力，提高植物的抗病害能力有一定的参考意义。

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