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连翘苷对小鼠遗传物质的损伤作用

2014-03-26赵咏梅张思琪

关键词:染毒连翘肝细胞

赵咏梅,张思琪

(西安文理学院 生物技术学院,陕西 西安 710065)

连翘(Forsythiasuspense(Thunb.))为木犀科连翘属植物,是中国临床常用传统中药之一。中医认为, 连翘根、茎、叶及果实皆可入药,其味苦、性微寒,归肺、心、胆经,具有清热解毒、散结消肿、疏散风热的功效。连翘苷是从连翘的干燥果实及叶中提取的主要活性物质之一,在前期的研究中,笔者证实了连翘苷不仅具有清除自由基、减肥降血脂作用,还能够抑制线粒体的氧化损伤[1-2]。同时,有学者研究发现,低剂量连翘苷可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的神经细胞损伤,增加细胞活性[3]。目前,连翘已广泛用于炎症、病毒、发烧、溃疡的治疗[4-8],其存在的遗传毒性也逐渐被人们所认识。王虹等[9]认为,高浓度的连翘水提物能明显提高哺乳动物精子畸形率,连翘中另一重要活性物质连翘酯苷对细胞的遗传毒性和对小鼠的急性毒性作用也已得到证实[10-11]。然而关于连翘苷遗传毒性的研究还未见报道。为了给临床用药提供依据,在前期研究的基础上,本试验对连翘苷的遗传毒性进行了研究,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 动 物 ICR小鼠,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,雌雄各半,体质量(20±2) g/只。基础饲料由西安交通大学医学院实验动物中心提供。试验前,小鼠在温度为(23±3) ℃、相对湿度为 50%~70%的动物饲养室内适应喂养1周,12 h照明循环。

1.1.2 连翘苷 从采自秦岭北麓蓝田灞源段的连翘叶中提取的连翘苷,经检测纯度达96%。试验前,用质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠溶液溶解连翘苷,100 Hz超声助溶。

1.1.3 主要仪器 DYY-6C细胞电泳仪、奥林巴斯BX-51荧光显微镜和SigmaTDL-5台式高速离心机等。

1.2 方 法

1.2.1 连翘苷对小鼠的急性毒性 将小鼠根据体质量随机分组,每组6只,雌雄各半,依据半数致死量(LD50)计算的设计原则,分别腹腔注射不同剂量的连翘苷溶液0.5 mL/只(剂量分别为1 500,1 250,1 000,750,500和250 mg/kg)1次,进行急性毒性试验,连续观察10 d,记录小鼠的死亡数,以改良寇氏法[11]求LD50:

LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]。

式中:Xm为最大剂量组剂量的常用对数值;i为剂间比的常用对数值;p为各组死亡率。

1.2.2 连翘苷对小鼠骨髓嗜多染红细胞的影响 将健康小鼠随机分阳性对照组、阴性对照(溶剂)组及4个连翘苷染毒组,每组5~6只小鼠。阳性对照组小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液0.5 mL/只,剂量为45 mg/kg,连续注射2 d,每天1次;阴性对照组小鼠腹腔注射质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠溶液0.5 mL/只,连续注射5 d,每天1次;连翘苷染毒组小鼠分别腹腔注射不同剂量的连翘苷0.5 mL/只(剂量分别为250,500,750和1 000 mg/kg),连续注射5 d,每天1次。在最后一次给药6 h后,将各组小鼠颈椎脱臼处死,取出股骨,常规方法收集小鼠骨髓嗜多染红细胞,经涂片、固定和瑞氏染色,显微镜400倍下计数微核细胞数和总核异常细胞数。每试验组计数1 000个细胞,计算细胞微核率和总核异常细胞率。

1.2.3 连翘苷对小鼠肝细胞DNA的影响 取1.2.2 中给药处理各组小鼠肝组织,取材大小为0.8 cm×(0.8~1.0) cm,剪碎,加入4~5滴PBS液混匀,以 1 000 r/min离心匀浆5 min,保留上清液。双层制胶法准备电泳试验,第一层胶用预热质量分数 0.7%正常熔点胶,待其凝固后,将小鼠肝细胞与质量分数0.7%的低熔点琼脂糖按体积比1∶4混匀作为第二层胶,铺在第一层胶体的载玻片上,盖上盖玻片,4 ℃凝固。经裂解、解旋后,在电压18 V、电流300 mA条件下电泳20 min。经蒸馏水中和、Goldview染液染色后,在荧光显微镜下用515~560 nm的激发光观察,各组在400倍镜下随机选取 2 000 个细胞,观测细胞拖尾图像,统计拖尾细胞数,并计算拖尾细胞率。

1.2.4 连翘苷对小鼠精子细胞的影响 雄性小鼠分组及处理方法如1.2.2节。染毒后第10天处死小鼠,取出副睾,纵向剪开,浸泡于盛有1 mL生理盐水的平皿中,静置3 min后轻轻摇动。用四层擦镜纸过滤,吸滤液涂片。经干燥、甲醇固定、伊红染色1 h后,在400倍镜下检查精子形态,计数头尾结构完整的精子。每只小鼠检测1 000个精子。

2 结果与分析

2.1 连翘苷对小鼠的急性毒性

试验期间,经1 000 mg/kg及以下剂量连翘苷染毒处理的各组小鼠均存活,无不良反应或异常行为。10 d后测试表明,与对照组相比,各组小鼠体质量无任何差异(数据未列出)。1 500和1 250 mg/kg 剂量连翘苷染毒组分别有3只和1只小鼠死亡;并且存活小鼠出现体质量变化,用改良寇氏法求得半数致死量LD50为1 086 mg/kg。

2.2 连翘苷对小鼠骨髓嗜多染红细胞的影响

正常嗜多染红细胞是由晚幼红细胞将核排出后形成的无核细胞,如果晚幼红细胞染色体发生突变就会在嗜多染红细胞中产生微核并造成其他核异常。本试验中,经连翘苷处理的嗜多染红细胞有微核产生,典型的微核为圆形,边缘整齐,在一个细胞内有1个或多个微核,大小为主核的1/10~1/5(图1-A),或在有丝分裂中形成染色体断裂片段(图1-B)。总核异常包括形成微核、染色体断裂、核空泡、核破碎等现象。经对每试验组1 000个嗜多染红细胞的观察和计数,连翘苷对小鼠微核和总核异常的影响如表1所示。表1表明,随着染毒剂量的增加,连翘苷染毒处理的各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率和总核异常率逐渐上升;与阴性对照组相比,500~1 000 mg/kg剂量组及环磷酰胺阳性对照组微核率和总核异常率均极显著升高(P<0.01)。说明一定剂量的连翘苷可使小鼠细胞染色体发生突变,对其遗传系统造成损伤。

图1 连翘苷对小鼠骨髓嗜多染红细胞的影响(400×)

表1 连翘苷对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率及总核异常率的影响(n=1 000)

2.3 连翘苷对小鼠肝细胞DNA的影响

染毒处理5 d后,经彗星电泳试验,小鼠肝细胞的DNA拖尾率见表2。

表2 连翘苷对小鼠肝细胞DNA拖尾的影响(n=2 000)

表2表明,连翘苷染毒处理后,随着染毒剂量的增加,各染毒组小鼠肝细胞DNA拖尾率与阴性对照组相比,差异无统计学意义,且DNA拖尾率变化无明显规律性;环磷酰胺组肝细胞DNA拖尾率与阴性对照组相比,差异极显著(P<0.01)。说明在受试剂量下,连翘苷不会对小鼠肝细胞DNA造成损伤。

2.4 连翘苷对小鼠精子的影响

经对每染毒剂量约6 000个精子细胞的观察和计数,连翘苷对小鼠精子的影响如表3所示。表3显示,随着连翘苷染毒剂量的增加,各组小鼠精子畸形率逐渐上升;与阴性对照组相比,500~1 000 mg/kg 3个剂量组精子畸形率显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于阴性对照组,并呈现剂量效应关系,提示连翘苷在小鼠体内对生殖细胞有致突变作用。畸形精子形态异常,主要表现在头部,其次为尾部,畸形类型表现为香蕉形、无钩、胖头、双尾、尾折叠、无定形等(图2)。

表3 连翘苷对小鼠精子畸形率的影响(n=6 000)

图2 连翘苷对小鼠精子的致畸作用(400×)

3 讨 论

遗传毒性研究是连翘苷非临床安全性评价的重要内容,通过对受试动物的体外和体内试验,研究连翘苷直接或间接诱导遗传学损伤的机制,是其进入临床试验及上市的重要环节。由于一种遗传毒性检测方法通常只能反映1个或2个遗传学特征,不能覆盖所有的遗传学特征,故本研究在检测连翘苷的遗传毒性时,采用了互相补充的骨髓微核试验和彗星试验,并对连翘苷的小鼠精子致突变作用进行了检测。

微核试验是检测细胞核或染色体损伤的一种遗传毒性试验方法,微核率可以反映遗传物质受伤的程度。本研究表明,连翘苷剂量达500 mg/kg以上时,随着剂量的增加,小鼠嗜多染红细胞微核率上升,说明在连翘苷的作用下,嗜多染红细胞在有丝分裂后期发生了染色体片段断裂或染色体落后,这些断裂的染色体片段或落后的染色体在末期单独形成了1个或几个规则的次核。表明一定剂量的连翘苷可使小鼠细胞染色体发生突变,具有一定的遗传毒性。

彗星试验是一种检测单个细胞DNA断裂情况的技术,若细胞核受损,DNA的降解片段在电场中泳动迁移,经染色后会看到类似彗星尾巴形状指向阳极,呈现出特有的彗星拖尾图像[12],用该技术检测连翘苷对DNA的损伤作用,更加快速、简便、灵敏。研究结果显示,连翘苷染毒处理下,小鼠肝细胞DNA断裂数并未增加,拖尾率与阴性对照组相比,差异无统计学意义,说明在受试剂量下,连翘苷不会对小鼠肝细胞DNA造成损伤。

小鼠精子畸形试验可检测环境因子对生殖细胞生成和发育的影响。已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果,因此形态的改变提示有关基因及蛋白质产物发生了改变[13]。连翘苷染毒处理使小鼠精子畸形率逐渐上升,表明连翘苷在雄性小鼠体内对精子有致突变作用。

按照世界卫生组织规定的化学物质急性毒性分级标准,连翘苷属于实际无毒物质[14]。然而,高浓度的连翘苷不仅能使小鼠细胞染色体发生突变,同时对精子有致突变作用,故连翘苷的用量还需斟酌。同时,本试验结果表明,连翘苷未对小鼠肝细胞DNA 造成损伤,提示连翘苷的遗传毒性可能是因为使相关蛋白质产物发生了改变而产生的,并无损伤遗传基因的能力,其遗传毒性产生的机理还需进一步研究。

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