乔凤杰，李炯书，欧阳亚旭，李意颖，黄永虹，孙宜君，常 蓉，李博生

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系，北京100083;2.林业食品加工与安全北京市重点实验室(北京林业大学)，北京100083;3.锡林郭勒苏尼特碱业有限公司，内蒙古锡林郭勒011200;4.北京林业大学螺旋藻研究所，北京100083)

由于全球范围内的环境污染和化石燃料的日益消耗，新能源的研究成为近几十年来的研究热点。新能源又称非常规能源，是指传统能源外的各种能源形式，包括太阳能、风能、地热能、生物质能、核能等。生物柴油是新能源的一种，它燃烧性能好，含硫量低，可代替化石燃料，是一种可再生的绿色新能源［1］。目前生产生物柴油的主要原料为动植物油脂。据统计，2011年世界植物油的总产量约为1.45亿t，在满足食用和化工生产的前提下，不足以用来规模化生产微生物柴油。微生物油脂脂肪酸的组成同植物油类似，也可用于生产生物柴油。微生物油脂在生产生物柴油具有以下优势:a.微生物代谢速度快、培养周期短、油脂含量高;b.微生物生长不受季节和时间的限制，可一年四季连续生产;c.适应性强，有些甚至可以在盐碱湖，滩涂、生活污水中生长。因此大力研究微生物油脂，为生物柴油提供量大而廉价的原料具有广阔的发展前景［2］。

一些微生物细胞内贮存的油脂含量超过其细胞干重的20%，这类微生物称为产油微生物。产油微生物主要包括产油微藻、霉菌和酵母［3］。粘红酵母是产油酵母的一种，又叫红酵母，属半知菌纲，壳霉目，杯霉科。细胞圆形、卵形或长形。粘红酵母油脂含量较高，可利用各种碳源和氮源，具有较强的环境适应性，是良好的产油菌种。粘红酵母培养基的组成，营养元素的含量、额外添加的小分子促进物质以及不同的培养方式均会影响粘红酵母的产油状况。本文总结了影响粘红酵母生产微生物油脂的主要因素及其相关进展，并对粘红酵母生产微生物油脂的发展方向进行了初步的探讨。

1 培养基在促进粘红酵母产油方面的研究进展

1.1 粘红酵母基础培养基的研究

粘红酵母可利用葡萄糖、糖蜜、木糖、蔗糖等多种碳源，其中，对葡萄糖的利用能力最强［4］。无机氮源和有机氮源同时存在时粘红酵母产脂效果最好。硫酸铵是最有效的无机氮源，酵母粉和蛋白胨是利用较好的有机氮源。现在常用的葡萄糖基本培养基配方为葡萄糖40g/L，酵母粉1.5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾 7g/L，硫酸钠 2g/L，七水硫酸镁 1.5g/L［5－7］。王敏等研究了4种不同配方的葡萄糖培养基对粘红酵母的影响，结果显示，培养基(g/L):葡萄糖100，蛋白胨1.8，(NH4)2SO42，KH2PO42，pH5.8 所得油脂产量最高，随后又对该培养基进行了优化，结果发现葡萄糖浓度80g/L，硫酸铵2g/L，蛋白胨2g/L，最有利于粘红酵母积累油脂。在此过程中还发现，不同种类的氮源作用不同，有机氮源有利于菌体的生长，无机氮源有利于油脂的积累［8］。

1.2 限制营养条件促进粘红酵母产油的研究

通常，培养基中的碳源丰富而某些其他元素缺乏的情况下可以促进粘红酵母合成油脂。其中降低氮元素的浓度是较为有效的方法。王敏等人的研究表明，在对粘红酵母31596培养的过程中，碳氮比由100增加到160的过程中，粘红酵母的油脂含量不断增加［8］。L.－M.Granger等人在对粘红酵母 NRRL YY 1091培养的过程中发现，随着碳氮比的不断增加，细胞内的油脂含量不断增加，当碳氮比为38时，细胞内的油脂含量达到32%［9］。Teresa Braunwald等人在研究碳氮比对粘红酵母ATCC 15125的油脂合成的影响中发现，在氮源的浓度不变，提高葡萄糖的量将碳氮比由20提高到70的过程中，油脂产量由0.2g/L提高到0.5g/L左右，而进一步提高到120时，油脂产量没有增加［10］。

此外，培养基中的磷、镁等元素也会对油脂的合成起到一定的作用。刑旭等在优化粘红酵母发酵味精废水的研究中发现，向培养基中添加1g/L的MgSO4后，生物量和油脂产率均有所增加，同空白相比，生物量增加了27.8%，油脂含量增加了5%［6］。L.－M.Granger等人研究还发现，虽然限制磷元素不如限制氮元素在促进粘红酵母NYYL Y 1091生产油脂方面有效，但将溶液中的C/P为208提高到310左右时，其油脂含量增加了约5%［9］。Siguo wu等人在研究另一种产油酵母圆红冬孢酵母时发现，在氮源丰富的情况下，降低磷的含量，既可以保证较高的生物量，同时还可以增加细胞内的油脂含量，实验中，将C/N控制在22.3，当 C/P由72增大到2045时，油脂含量由21.2%增加到42.6%，两种情况下生物量维持在18.6g/L左右。该营养状况在粘红酵母培养方面的研究还未见报道，有必要进行进一步的研究，为其在含氮高的工业废水中进行培养提供指导［11］。

1.3 粘红酵母廉价培养基的研究进展

成本问题是规模化生产生物柴油面临的最大问题，据统计，生物柴油生产中原料成本约占总成本的75%［12］。因此，寻求适合粘红酵母生长廉价培养基成为粘红酵母能否工业化生产生物柴油的关键。工农业生产中一些高浓度的有机废弃物，经过一定处理后，可用于粘红酵母的培养，降低了生产成本，对废弃物也进行了一定的处理，减轻了环境压力。

1.3.1 木质纤维素类水解液用于粘红酵母培养 含有大量纤维素半纤维素类的物质统称为木质纤维素。木质纤维素来源广阔，包括农作物收获后的残渣如秸杆、蔗渣、木屑、纸张和一些草本植物和木材等［13］。经过一定的物理、化学处理，木质纤维素可以转化为含有单糖的水解液，通常含有葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖。其中，葡萄糖和木糖含量较高，这两种糖约占水解后总糖的72%～94%，木糖和葡萄糖的比约为2.6～4.7∶1。因此，粘红酵母对木糖的利用能力直接关乎到其对木质纤维素水解液的利用情况。

研究表明，粘红酵母可以利用木糖进行代谢。潘丽霞等利用木糖培养基从土壤中分离筛选出两株高产油的酵母菌，根据常规形态和26rDAN序列分析结果，确定其中一株菌为粘红酵母［14］。李建等对粘红酵母生长的最适木糖深度进行了探索。结果表明，高的木糖初始浓度对粘红酵母的生长和生产油脂具有一定的抑制作用。当木糖浓度范围设置在50g/L以下时，随着浓度增加，生物量和产油量也随之增加，但超过35g/L后，其生物量和产油量又开始降低［15］。李堑对粘红酵母的戊糖运输蛋白进行了研究，实验中提取质膜蛋白时发现，有一种分子量约为35k的质膜蛋白，在低木糖浓度的环境中诱导表达，而在高浓度的葡萄环境中则抑制表达。该蛋白的大小同假丝酵母中木糖运输蛋白的大小接近，初步推测，该蛋白为粘红酵母的木糖运输蛋白［16］。何霞清等采用PT－PCR扩增技术成功获取了粘红酵母的特异木糖跨膜转运基因。进一步从理论上证实了粘红酵母对木糖的利用能力［5］。但是，木质纤维素水解产物成分复杂，其中一些副产物可能对粘红酵母的生长具有一定的抑制作用。李堑的研究发现，水解液中的糠醛和乙酸的浓度大于2g/L时，粘红酵母不可生长，当浓度小于1g/L时，随着糠醛和乙酸浓度的减小，生物量呈上升趋势。以蔗渣和玉米芯水解液作为碳源培养粘红酵母，其生物量最大分别可达15.1g/L 和 13.7g/L［16］。

1.3.2 食品工业废水用于粘红酵母的培养 粘红酵母可以利用多种的底物进行发酵，一些工业废水尤其是食品工业废水中含有丰富的碳、氮、磷等粘红酵母生长所需要的元素，经过适当地调整后，可用于粘红酵母的培养。味精废水是一种高浓度的有机废水，研究表明其较为适合粘红酵母的生长。

薛飞燕等用味精废水分别培养Rhodotorula glutinis Saccharomyces cerevisiae－2、candida utilis iae－2、Saccharomyces cerevisiae，结果表明，在培养到第五天时，粘红酵母的生物量明显高于其他三种微生物［17］。T.Schneider等人利用啤酒厂废水对粘红酵母进行培养，结果表明，啤酒厂废水中含有丰富的氮源和其他营养物质，可用于粘红酵母的培养，但是啤酒厂废水中主要为麦芽糖，需进一步提高粘红酵母对麦芽糖的利用率，以增加其生物量和产油量［18］。Zhanyou Chi等人将食物残余水解后用于培养 C.curvatus，R.glutinis，Y.lipolytica，R.toruloides 和 L.starkeyi，结果显示，食物残余水解液不会抑制 C.curvatus，R.glutinis，Y.lipolytica三种菌的生长，其生物量和葡萄糖培养基作为对照培养相近［19］。Teresa Schneider等利用马铃薯、果汁和莴苣加工过程中产生的废水来培养粘红酵母，结果发现，粘红酵母在果汁加工废水中生长最好，其生物量约增加了6倍，而在马铃薯废水中其生物量有所下降，在莴苣加工废水中其生物量没有明显增加。用HPLC检测后，在果汁废水中检测到了葡萄糖和木糖，在其他两种废水中没有检测到，原因可能和其他两种废水糖含量较低有关［20］。

用于培养粘红酵母的工业废水来源广阔，但是工业废水往往营养成分不足，需要向其中添加其他营养物质，在添加的过程中不可避免地增加了其成本，因此，考虑多种废水混合培养是一种可行的方法。刑旭在研究味精废水对粘红酵母的培养中，向其中添加10g/L葡萄糖厂葡萄糖母液后，每升废水中产油脂总量增加了近2g，生物量由7.25g/L增加到13.16g/L，油脂产量由 1.49g/L 增加到 3.46g/L［5］。由以上可以知，可用于培养粘红酵母的废水种类多，来源广，但是缺乏对某一些较适合的废水的深入研究。若对某些废水深入的分析其营养组成，进一步优化其营养组成，有望实现较高的生物量和产油量。

2 不同培养方式在粘红酵母生产油脂方面的研究进展

文章前面部分已经提到，提高溶液的碳氮比可以提高酵母细胞内的油脂含量。然而，在氮元素受限制的情况下，细胞内蛋白和核酸的合成会受到限制，细胞不能进行大量的增殖，生物量下降，这就会影响到最终的油脂产量。若采用分段培养的方法，在培养的前期使用氮源丰富的培养基，使细胞大量的增殖，达到较大的生物量，在后期使用碳氮比较高的培养基，促进细胞大量的合成油脂，则可以提高总的油脂产量。Chanika Saenge等人在用棕榈油废水对粘红酵母进行培养的过程中通过响应面实验得出粘红酵母生长的最佳碳氮比为140，油脂含量最佳的碳氮比为180，采用分段式培养后，油脂产量由3g/L增加到4.58g/L［21］。Guochang Zhang 等用人工合成的木质纤维素水解液对粘红酵母进行分段培养，前一阶段在氮源丰富的培养基中，当粘红酵母到达稳定期后将其转移到缺氮培养基中，油脂含量由4.3%增加到 39%［22］。

粘红酵母同其他产油微生物混合培养，种间的相互作用也可提高其总的油脂含量。如粘红酵母同微藻类混合培养，微藻类细胞大多进行光合作用，吸收CO2，放出O2，而粘红酵母是异养微生物，在这一点上，正好进行相反的过程，二者的这种相互促进的关系，以及其他方面的互作，最终可提高粘红酵母产油量。苗金鑫等研究了在味精废水中混合培养粘红酵母和螺旋藻，粘红酵母和螺旋藻分别单独培养时，其油脂产量为1.58g/L和0.23g/L，混合培养中，在粘红酵母培养3d后接入10%螺旋藻后，油脂产量增加到 2.24g/L［23］。Benjamas Cheirsilp 等人在研究海鲜废水和糖蜜废水混合培养粘红酵母和小球藻的过程中发现，单独培养到第七天时，粘红酵母的细胞数目为3.4×106，混合培养时粘红酵母时细胞数目为3.8×106。Feiyan Xue等［24］将粘红酵母和螺旋藻进行混合培养，混合培养后总油脂产量和油脂含量均比粘红酵母单独培养时有所提高［25］。

批式培养、补料—批式培养和连续培养是实验室常用的三种培养微生物的方式。批式培养的过程中，培养基中的营养物质会不断的消耗，微生物分泌的有害物质也会逐渐积累，某些代谢物也会导致培养基中pH的变化而不利于微生物的生长。因此，批式培养获得的生物量相对较低。补料—批式培养是在培养的过程中定期的调整营养物质的水平，连续培养是在培养的过程中适时地添加新的培养液，流出旧的培养液，使营养物质一直保持在恒定的水平。这两种培养方式相对于批式培养均具有一定的优势。Feiyan Xue等研究了在用味精废水培养粘红酵母的过程中采用不同的添加葡萄糖的方式对粘红酵母的影响。结果表明，补料批式培养要比批式培养的生物量有所增加［26］。Xin Zhao等研究了不同培养方式对圆红冬孢酵母培养的影响，结果显示，采用补料—批式培养时油脂产量为0.36g/L/h，而采用连续培养油脂产量可以达到0.57g/L/h。由此可见，补料－批式培养和连续培养的确有利于微生物的生长和油脂积累，应进一步加强粘红酵母在该方面的研究［27］。

3 培养条件在粘红酵母产油方面的研究进展

除营养条件和培养方式外，粘红酵母的培养条件，也会影响到粘红酵母细胞的生长状态和相关酶的活性，从而会影响油脂的产量。普遍的研究表明，粘红酵母最适的生长温度为28～30℃，最适pH为5.0～5.5，较适宜的接种量为5%～10%［8，28］。除以上基本的条件外，一些其他因素，如溶氧、光照和一些活性物质的添加等也会对粘红酵母生长和油脂积累起到较大的影响。Hong wei－Yin等研究了溶解氧对粘红酵母的影响。在5L的发酵鑵实验中发现，当溶解氧为60%时，生物量为56.6g/L，油脂含量为47.3% ±7.2%，当溶解氧为25%时，生物量为35.8g/L，油脂含量为63.4% ±5.6%。由上可知，培养基中氧气充足，有利于粘红酵母生物量的增加，不利于油脂的积累［29］。Chanika Saenge在用棕榈厂的废水对粘红酵母进行培养的过程中发现，向其中添加表面活性剂吐温20，粘红酵母的生物量约提高12%，油脂含量增加约10%［21］。作者所在实验室研究了螺旋藻蛋白酶解产物对粘红酵母生长的影响，螺旋藻蛋白经不同各类的酶酶解后，其产物均对粘红酵母的生长具有一定的促进作用，其中作用最明显的碱性蛋白酶酶解产物，在培养96h后，生物量同对照相比提高了约30%。Hong wei－yin等还研究了光照对粘红酵母的影响，用红色、蓝色、绿色、白色LED灯对粘红酵母进行照射但同对照相比，增加光照后可明显增加粘红酵母的生物量，对照生物量约为38.3g/L，灯光照射后生物量约为52g/L。光照后油脂含量有轻微的下降，总的油脂产量增约33%。但不同波长的灯光对粘红酵母的影响差别不明显［30］。以上方法均可有效地促进粘红酵母生产油脂，因此，进一步探索促进粘红酵母生长和产油的因素也具有重要价值。

4 粘红酵母油脂成分的分析

粘红酵母油脂脂肪酸的组成主要为C16和C18系的脂肪酸，主要为油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。于雅潇用GC－MS对在葡萄糖培养基中粘红酵母的油脂成分了分析，其中油酸58.21%，棕榈酸19.84%左右，亚油酸和硬脂酸分别约为15.04%和6.91%。当向培养基中添加氨基酸或者有机酸等小分子的碳源时，油脂含量分布有一定的变化，主要脂肪酸种类没有发生变化［31］。Chankia Saenge等在用棕榈油生产过程的废水对粘红酵母培养后对其油脂成分进行分析，其中，油酸为47.88%，棕榈酸20.37%，亚油酸7.31%，硬脂酸10.33%［23］。Easterling等人以甘油为碳源对粘红酵母进行培养后，其油脂成分为油酸为18.05%，棕榈酸16.01%，亚油酸 15.91%，硬脂酸21.86%［32］。在生物柴油的生产中，欧盟80%的原料为双低菜籽油(低硫甙、低芥酸)，美国、巴西主要是大豆油。菜籽油的主要脂肪酸组成为油酸为22.3%，棕榈酸 8.9%，亚油酸 40.1%，亚麻酸9.2%［33］。大豆油其主要脂肪酸组成为油酸为20.7%，棕榈酸11%，亚油酸54.2%，亚麻酸8.9%［34］。同这两种植物油相比，粘红酵母油脂同其主要脂肪酸的种类相似，且粘红油酵母脂脂肪酸的饱合度较高，理论上讲，其热值会相对较高，比植物油脂不易氧化，具有更高的稳定性。粘红酵母油脂生产生物柴油，同样具有低S、N的环保特性，同传统的柴油相比，其十六烷值高，燃烧性能好，同时其闪点高，安全性更好。因此，粘红酵母油脂在生产生物柴油方面有一定的前景［35］。

5 粘红酵母工业化生产油脂存在的问题及展望

由于粘红酵母代谢速度快，生长周期短，可利用多种营养物质进行发酵，在生产微生物油脂方面具有广阔的前景。如果实现工业化生产油脂，还有许多工作要做。首先是廉价培养基方面的问题［36］。在现阶段的研究中，用于培养粘红酵母的废水种类很多，但是大多数的研究还处于初级阶段。从文献报道来看，主要利用废水进行适当的稀释或者添加一定量的大量元素就用于培养粘红酵母，未对废水中的微量元素进行详细测定，对其中的抑制物质研究仅在以纤维素水解液作为培养基中有所涉及，其他废水中研究很少，因此，不能较好地满足粘红酵母的营养需求，难以达到较高的产油量。如果在现有研究的基础上，选择利用价值较高的废水，如味精废水和糖蜜废水，对其中的物质进行全面的分析和进一步调节营养配比，使其满足粘红酵母的营养需求，从而提高油脂产量。如果仅仅利用一种废水，通常需要添加其他营养物质才可满足粘红酵母的生长需要，这样会导致生产成本升高，不利于实现规模化生产。因此，需要在不同的废水营养组成研究的基础上，根据不同废水的物质组成特点，利用两种或以上的工业废水配合使用，取长补短，达到粘红酵母的营养基本需求，可以减少物质添加，从而降低生产成本。

当前的研究报道中，促进粘红酵母生长和产油的方法和条件很多，比如发酵罐连续培养、分段培养、控制溶氧、添加表明活性剂和光照刺激等，但是这些研究大多是单独进行，并没有将有效的方面结合起来。利用优化后的培养基，将行之有效的促进条件结合起来，将更有利于粘红酵母油脂的积累。例如，可将批次培养取得的优良廉价培养基进行发酵罐放大，采用分阶段连续培养的方式，结合其它促进条件(如适当光照、添加表面活性剂和溶解氧等)，控制C/N比、C/P比等可有效提高产油量的条件，必将极大的提高粘红的油脂产量。这样通过有效的放大实验研究，确定培养条件的参数，为中试和产业化生产打下基础。此外，现阶段对粘红酵母的研究主要集中在油脂方面，对蛋白质和多糖及其它物质的研究较少，没有重视粘红酵母的综合利用，马淑琴等人的研究发现，啤酒酵母多糖可以促进小鼠脾脏淋巴细胞的的增殖，起到增强免疫功能的作用［37］。酵母中的蛋白含量也较高，且其必需氨基酸含量丰富，在饲料中有广泛的应用［38］。应加强对提取油脂后粘红酵母剩余物中蛋白、多糖和色素等物质的进一步利用，提高产业化整体经济效益。

综上所述，粘红酵母工业化生产油脂具有广阔的前景，相信随着研究的深入，其廉价培养基技术和培养方法会更加成熟，在放大培养和中间实验参数的确定基础上，逐渐实现利用粘红酵母生产油脂的产业化。

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