杨 雄，刘秀侠，南 昊，许晓东，陈红英

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的一种病毒性传染病。自1981年发现以来，该病已经肆虐全球，严重危害到人类生命与健康。目前普遍采用联合使用抗逆转录病毒药物来控制AIDS的进程，延长病人的存活时间，但这些药物不能彻底清除感染者体内的病毒，而且治疗费用昂贵，存在不同程度的副作用。加上HIV-1具有变异率高的特点，为了控制病毒突变体的产生和积累，需要换用不同的药物，增加了艾滋病治疗的成本与难度。因此，迫切需要研制一种安全、有效、廉价并能广泛使用的HIV-1疫苗，来预防和控制HIV-1的流行[1]。一些具有广谱中和性作用的抗体的发现、分离及对其相应抗原表位的鉴定，为HIV-1疫苗的研究带来了新的希望。近年来，人们发现了几种广谱中和性抗体，如b12、2F5、4E10、2G12、PG9和PG16，以及最近发现的VRC01、VRC02和VRC03等，能够识别HIV-1病毒包膜蛋白上相对保守的表位，在体外能有效中和HIV-1病毒各亚型的毒株[2]。这些广谱中和性单抗的发现为研制可诱导中和性抗体产生的疫苗提供了思路[3]。对这些抗体分子进行深入研究，阐明其识别的HIV-1抗原表位，对于可诱发保护性抗体的抗原表位设计具有重要意义。

b12是第1个被证明具有广谱中和活性的单抗，它的Fab片段来源于噬菌体展示文库[4]，为人源化的单抗，其可识别HIV-1 gp120上与CD4受体分子结合部位部分重叠的高度保守的构象依赖型表位[5]。b12可以通过伸出的较长的CDRH3(18aa)环结合HIV-1 gp120的CD4识别位点，阻止HIV-1与靶细胞上受体的结合，表现出病毒中和作用，从而抑制HIV-1的感染。b12可以中和约75%的B亚型的HIV-1分离株[5]，是目前已知的在体内和体外均能特异性结合HIV-1 gp120保守区域的广谱中和性抗体[6]。

单链抗体(Single chain variable fragments，scFv)是一种基因工程抗体，是用一段连接肽将抗体轻链可变区(VL区)和重链可变区(VH区)连接而成的重组蛋白，它保留了亲本抗体的全部抗原结合特异性，连接肽通常使用3次重复的GlyGlyGlyGlySer[(G4S)3]。与完整抗体相比，scFv具有分子质量小、免疫原性低、组织穿透性好、易与靶点结合等优点[7]。Jiang等[8]和Mason等[9]的研究证明，scFv与完整单克隆抗体一样具有中和病毒的能力。

基因从头合成技术已经成熟，该技术是目前快速获得已知基因序列的可靠方法。本研究根据文献[10]报道的b12抗体的轻链和重链氨基酸序列，依照大肠杆菌密码子偏爱性，将氨基酸序列转换、优化成DNA序列，再设计2对引物Ncob12L-F、G4SLight-R和G4SH-F、XhoH-R，分别扩增其轻链和重链可变区基因，然后用引物Ncob12L-F和XhoH-R通过重叠PCR的方法将二者人为拼接起来，并克隆到原核表达载体上，在大肠杆菌中诱导表达，并用Ni-NTA金属螯合层析柱的方法从大肠杆菌细胞破碎液的上清中纯化获得了可溶性的b12单链抗体，检测其与HIV-1 gp120的结合活性，以期为深入研究b12单链抗体与HIV-1抗原分子的相互作用及设计新型有效的HIV-1疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体pET28a、大肠杆菌(Escherichiacoli) Top10、大肠杆菌BL21 StarTM(DE3)来自Novagen公司。Sf9细胞来自Invitrogen公司。b12抗体轻链和重链全基因由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。

1.1.2 工具酶及生化试剂Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ， 均购自Fermentas公司；T4 DNA连接酶和SDS-PAGE电泳标准蛋白，为Takara公司产品；凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和质粒DNA小量抽提试剂盒、ELISA显色试剂盒，均购自生工生物工程(上海)有限公司；Ni-NTA金属螯合层析柱，购自Merck公司；抗组氨酸(His)标签鼠单克隆抗体、HRP和FITC标记的山羊抗鼠IgG，购自康为世纪生物公司；PVDF膜，购自Millipore公司；DNA Marker，购自Biomed公司。

1.2 方 法

1.2.1b12-scFv基因片段的合成 依据b12的轻链及重链基因序列，设计2对引物，交由生工生物工程(上海)有限公司合成。轻链上游引物Ncob12L-F：5′-TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC-3′，5′端下划线部分为引入的NcoⅠ酶切位点；下游引物G4SLight-R：5′-GCTCCCGCCACCTCCAGA-GCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC-3′。重链上游引物G4SH-F：5′-GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCT-GGTGCAG-3′；下游引物XhoH-R：5′-TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC-3′，5′端下划线部分为引入的XhoⅠ酶切位点。分别用对应引物从合成的轻链与重链基因上扩增出其可变区基因片段，通过G4SLight-R和G4SH-F引物在轻链和重链之间引入编码(G4S)3间隔序列基因(Linker)，最后通过重叠PCR的方法拼接得到完整的b12-scFv基因序列。PCR反应体系为20 μL，内含2 μL 10×Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，上、下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA 20 ng和1 U的Pfu高保真DNA聚合酶。PCR扩增轻链和重链可变区的反应条件为:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。重叠PCR扩增单链抗体全长基因时，延伸时间为90 s，其他反应条件与可变区片段的扩增条件相同。PCR产物用试剂盒纯化后，用限制性内切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)进行双酶切，酶切体系为50 μL，其中10×Buffer R 5 μL、PCR产物25 μL、NcoⅠ 0.5 μL、XhoⅠ 0.5 μL、双蒸水19 μL，混匀后于37 ℃水浴酶切4 h。取全部酶切产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，按照凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段，即得b12-scFv基因，其结构表示为：scFv-VL-Linker-VH。

1.2.2 重组质粒pETb12-scFv的构建 用限制性内切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)对载体pET28a进行双酶切，电泳回收大片段。将b12-scFv基因片段与载体pET28a大片段按照物质的量比约为3∶1混合，在T4 DNA连接酶的作用下16 ℃过夜连接。用1 μL的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中于37 ℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。将鉴定结果为阳性的菌落接种到含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，按照质粒DNA小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，酶切产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时对质粒进行测序，测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。将测序结果与设计的DNA序列进行比对分析。将获得的阳性重组质粒命名为pETb12-scFv。

1.2.3 重组b12-scFv蛋白的诱导表达 将重组质粒pETb12-scFv转化至大肠杆菌BL21 StarTM(DE3)原核表达宿主感受态细胞中，将转化产物涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中于37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min培养过夜。将过夜菌液按体积比1∶50转接入含50 μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基，扩大培养，37 ℃、250 r/min条件下培养至菌液OD600=0.6～1.0(大约需要2.5 h)，留取部分菌液做未诱导对照，其余菌液加入IPTG使其终浓度为0.5 mmol/L，在室温下诱导4 h。诱导表达后将菌液于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，收集菌体，用PBS (pH 7.4) 缓冲液悬浮。

用超声破碎仪在冰浴条件下破碎悬浮菌体，超声功率为30 W，超声时间5 s，间隔时间5 s，破碎10 min。超声破碎后，将裂解的菌液于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，分别收集上清液和沉淀(沉淀用1/6 上清液体积的PBS缓冲液重悬)，加入2×蛋白上样缓冲液，进行100 g/L SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达及分布情况。

1.2.4 重组b12-scFv蛋白的亲和纯化 取1 mL固化Ni-NTA树脂装入层析柱中，树脂沉降后的体积定义为1个柱床体积。用3倍柱床体积的无菌水冲洗树脂，再加3倍柱床体积的结合缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L氯化钠，pH 7.8)平衡树脂，然后将超声波处理的细胞裂解液上清上柱，依次用6倍柱床体积的结合缓冲液、4倍柱床体积的洗涤缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L氯化钠，pH 6.0)分别洗柱，最后用50，100，200和300 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，分步收集，每个浓度梯度收集约1.5 mL。将纯化获得的蛋白做梯度稀释后，与已知浓度的蛋白分子质量标准对比估测浓度，计算纯化蛋白的产量。

1.2.5 重组b12-scFv蛋白与HIV-1 gp120结合活性的ELISA检测 真核分泌表达的HIV-1 gp120蛋白的制备方法如文献[11]所述。用包被缓冲液(0.05 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaHCO3，pH 9.6)稀释HIV-1 gp120蛋白(稀释度1∶10)，将稀释的HIV-1 gp120蛋白溶液加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。TBST(含1 mL/L Tween-20的TBS)洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL含50 g/L脱脂奶粉的TBST,于37 ℃封闭2 h，TBST洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL 2倍倍比稀释(从1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，总共8个质量浓度梯度，初始蛋白质量浓度为250 μg/mL)的待测b12-scFv，每个稀释度做2个复孔，37 ℃孵育2 h，同时设立不加单链抗体的阴性对照，TBST洗板3次，每次5 min。然后加入100 μL抗组氨酸(His)标签鼠单克隆抗体(稀释度1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次5 min；再加入100 μL HRP标记的山羊抗鼠IgG(稀释度1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次5 min。最后加入TMB显色底物，显色5 min后，加2 mol/L H2SO4终止显色，450 nm测定吸光值(OD450)。

1.2.6 重组b12-scFv蛋白与HIV-1 gp120结合活性的荧光显微镜观察和流式细胞仪(FCM)检测 细胞表面锚定表达有HIV-1 gp120的Sf9细胞的获得方法参见文献[12]，以不表达HIV-1 gp120的Sf9细胞作为阴性对照。1 000 r/min离心15 min收集细胞，用重组b12-scFv蛋白(稀释度1∶50)室温孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；然后加入抗组氨酸(His)标签鼠单克隆抗体(稀释度1∶200)，室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；再加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(稀释度1∶100)，室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；最后加入40 g/L多聚甲醛固定10 min后，1 000 r/min离心15 min收集沉淀，用PBS (pH 7.4) 缓冲液悬浮，在荧光显微镜下观察。

流式细胞分析使用CyFlow®Cube 6型流式细胞仪，激发波长488 nm，绿色荧光信号在FL1通道检测(发射波长530 nm)，收集数据使用CyView 8.5 软件。每个样品至少使用4×104个细胞收集数据，离线数据分析用FCS Express 4软件。

2 结果与分析

2.1 b12-scFv基因的合成

PCR扩增获得的轻链和重链基因片段经琼脂糖凝胶电泳后，得到约400 bp的特异性条带(图1-A，B)，片段长度与预期结果相符。重叠PCR产物的电泳检测结果发现，PCR产物有非特异扩增条带和拖尾现象，但最主要的扩增条带长约768 bp(图1-C)，与预期的b12-scFv基因全长相符。

图1 b12-scFv基因的PCR扩增

2.2 重组质粒pETb12-scFv的鉴定

重组质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后，经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可检测到除载体片段外，还有1条约800 bp的插入片段(图2)，长度与预期相符，表明目的基因已成功插入表达载体中。测序结果证实，pETb12-scFv的大小、读码框均正确，表明克隆得到了正确的重组质粒。

2.3 b12-scFv的诱导表达及SDS-PAGE分析

用重组质粒pETb12-scFv转化BL21 StarTM(DE3)菌，经IPTG诱导表达4 h后，超声破碎，100 g/L SDS-PAGE电泳分析，结果(图3)表明，破碎全菌、破碎上清液和沉淀均出现1条分子质量约为29 ku的条带，其大小与b12-scFv蛋白理论值相符，而未诱导对照则没有该条带，表明目的蛋白得到了表达，且表达产物大部分在上清液中，以可溶性蛋白形式存在，也有少部分以包涵体的形式存在。

图2 重组质粒pETb12-scFv的NcoⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定

2.4 b12-scFv蛋白的亲和纯化

采用Ni-NTA亲和柱纯化上清液中的可溶性蛋白，依次用50，100， 200和300 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，分步收集，取部分洗脱蛋白样品加入2×蛋白上样缓冲液，100 g/L SDS-PAGE电泳分析，结果(图4)显示，大量目的蛋白存在于200和300 mmol/L咪唑洗脱组分中。将这2个洗脱组分合并，从300 mL培养液菌体中纯化获得了总体积为3 mL的b12-scFv蛋白；取纯化蛋白小样进行梯度稀释，与已知浓度的蛋白标准对比，估测其质量浓度约为0.2 mg/mL。通过计算得出纯化蛋白的产量约为2 mg/L。

图4 单链抗体b12-scFv表达产物的纯化

2.5 b12-scFv与HIV-1 gp120结合活性的ELISA检测

ELISA检测结果(图5)表明，当b12-scFv的稀释度达到1/64，即蛋白质量浓度约为4 μg/mL时，其OD450数值仍为阴性对照的2.1倍以上，可以认为其为阳性， 表明b12-scFv与HIV-1 gp120具有较强的结合活性。

图5 b12-scFv与HIV-1 gp120结合活性的ELISA检测

2.6 b12-scFv与HIV-1 gp120蛋白结合活性的荧光观察及流式细胞仪检测

在荧光显微镜下可观察到，表达HIV-1 gp120的细胞表面发绿色荧光(图6-A，B)。FCM检测结果显示，表达HIV-1 gp120的细胞荧光强度明显高于不表达HIV-1 gp120的对照细胞(图6-C)，说明b12-scFv可以特异性地识别细胞膜表面的HIV-1 gp120。

图6 b12-scFv与细胞膜表面表达的HIV-1 gp120蛋白结合活性的检测

3 讨 论

用原核表达系统表达蛋白具有成本低、表达效率高等特点[12]，scFv一般都采用原核表达系统获得。尽管大肠杆菌不能进行糖基化修饰，但这对scFv的表达没有影响，因为scFv没有抗体稳定区，不需要糖基化来获得生物学活性。但是由于scFv是将抗体轻链和重链可变区人为拼接获得的重组蛋白，在高效的原核表达系统中往往以不溶性的包涵体形式存在，需要在变性剂存在的条件下溶解、纯化，然后经复性才能得到可溶性的具有抗原结合能力的单链抗体蛋白，而经过变性、复性过程获得的单链抗体一般产量较低，活性也会受到影响。已有的文献报道，b12的scFv也是从包涵体中经溶解、纯化和复性获得的[13]。本研究采用化学合成的方法获得了b12抗体重链和轻链的基因序列，用重叠PCR的方法拼接得到了b12-scFv基因，利用原核表达系统，在室温和IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下，诱导表达的b12-scFv主要以可溶性蛋白的形式存在，从1 L培养液中能纯化获得大约2 mg可溶性蛋白。纯化的蛋白具有良好的HIV-1 gp120结合活性。降低诱导温度与IPTG的浓度，延长表达时间，可能有助于增加可溶性蛋白的产量，最佳的表达条件有待于进一步研究。

本研究中报道的b12单链抗体可溶性较好，表达量较高，纯化过程简单，抗原结合能力好。用基因工程的方法在体外大量制备该抗体，可用于艾滋病的被动免疫防治[14]；在基于包膜蛋白的HIV-1重组疫苗的设计中，可用于b12抗原表位的检测，在HIV-1的被动免疫治疗和免疫原检测中具有一定的应用前景。

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