刘田田，蒋 向，许晓东

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

杆状病毒是一类主要感染节肢动物的病毒，其宿主通常为鳞翅目昆虫，此外还有膜翅目和双翅目昆虫[1]。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedro virus,AcMNPV)是杆状病毒科的模式种，其基因组长134 kb，共有154个开放阅读框。AcMNPV的基因表达为级联式调控，按基因表达时序可分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。

早期基因的上游序列是昆虫细胞的调节序列，其启动子可以被宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ及相关转录因子所识别，表达产物可满足完成病毒复制所需的条件。病毒DNA复制是晚期基因转录的先决条件，晚期基因的表达依赖于早期基因及其产物，并通过病毒自身编码的RNA聚合酶催化晚期基因的转录；此外，晚期基因的表达还需要一类蛋白因子调控，即晚期表达因子(Late expression factor,lef)。

瞬时表达试验证明，AcMNPV中与病毒DNA复制相关的基因有：DNA引物酶lef-1[2]、DNA引物酶辅助因子lef-2(也是病毒蛋白组分)[3]、单链DNA结合蛋白lef-3[4-5]、DNA聚合酶dnapol[6]、反式激活因子ie1[7]、DNA复制辅助因子lef-7[8]、转录激活因子ie2(ien)[9]、DNA解旋酶p143[5]和抗细胞凋亡基因p35[10]。在已知功能的10个晚期表达因子中，有4个编码RNA聚合酶的亚基：lef-4、lef-8、lef-9和p47[11]；而另外6个晚期表达因子为：lef-5(为转录起始因子而非延伸因子)[12]、lef-6(可以加速侵染循环)[13]、lef-10、lef-11(是DNA复制所必需的)[14]、lef-12(可以刺激晚期因子的表达)[15]和pp31(可以增强大多数病毒的转录水平)[16]。

体外晚期基因瞬时表达试验表明，有19个AcMNPV基因被确定为晚期表达因子[17-18]。而在这19个晚期表达因子中，目前关于lef-10的功能知之甚少。lef-10基因全长234 bp,编码78个氨基酸，相对分子质量为8.7 ku，是已知的相对分子质量最小的晚期表达因子。

本研究以AcMNPV全基因组为模板，分别构建包含lef-10、innateP-lef10和GFP融合基因的表达载体，感染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞，对其编码产物进行亚细胞定位及时空表达分析，以期为进一步研究lef-10基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和细胞

大肠杆菌Top10细胞、BL21(DE3)细胞、载体pTriEx-SP-GFP、Sf9细胞和pAc-GFP，皆由西北农林科技大学生命科学学院分子病毒学实验室保存；AcMNPV Bacmid来源于University of Reading,Prof. Ian Jones实验室。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量抽提试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司；限制性内切酶BspHⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ和XbaⅠ及T4 DNA连接酶、Unstained Protein MW Marker，均购自Fermentas公司；酵母浸粉和蛋白胨均购自北京奥博星生物技术有限公司；DNA Marker、抗GFP标签兔单克隆抗体、FITC标记的羊抗兔抗体，均购自康为世纪生物公司；Fugene HD转染试剂、碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)，均购自Roche公司；胎牛血清，购自Thermo Scientific HyClone公司。

1.3 引物设计与合成

参照AcMNPV基因组全序列[19]，构建lef-10及innateP-lef10基因重组质粒，用Primer Premier 5软件设计特异性扩增引物(表1)。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 lef-10及innateP-lef10基因重组质粒构建所用引物

1.4 lef-10及innateP-lef10基因重组质粒的构建

1.4.1lef-10及innateP-lef10基因的PCR扩增 以AcMNPV基因组DNA为模板，用引物Ac-lef-10-F/Ac-lef-10-R、Ac-innateP-lef-10-F/Ac-lef-10-R进行PCR扩增，扩增体系为：AcMNPV基因组100 ng，25 mmol/L MgCl22 μL，10×TaqBuffer 2 μL，25 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L上游引物Ac-lef-10-F/Ac-innateP-lef-10-F 1 μL，10 μmol/L下游引物Ac-lef-10-R 1 μL，Taq酶 0.2 μL，ddH2O补足20 μL；反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(lef-10)/2 min(innateP-lef10)，30个循环；72 ℃ 10 min,最后4 ℃保存。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物纯化试剂盒纯化后，-20 ℃保存。

1.4.2 pTriEx-lef10-GFP质粒的构建 用限制性内切酶BspHⅠ和BamHⅠ对上述PCR回收产物进行双酶切，然后用PCR产物纯化试剂盒回收，与以NcoⅠ和BamHⅠ双酶切pTriEx-SP-GFP质粒切胶回收的载体用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，然后按常规方法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于氨苄青霉素(50 μg/mL)抗性平板，培养过夜后挑单菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落接种至含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min过夜摇菌，用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，并对其进行XbaⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，将鉴定为阳性克隆的重组质粒送往上海生工生物工程有限公司测序，构建正确的重组质粒命名为pTriEx-lef10-GFP。

1.4.3AcMNPVlef-10天然启动子的确定 根据杆状病毒早期基因核心启动子元件的保守基序，即TATA元件、起始子基元序列(INR)ATCA(G/T)T(C/T)、下游活化区元件(DAR)(A/T)CACNG及远侧上游活化区元件(UAR)A(A/T)CGT(G/T)，找到了位于lef-10上游近1 676 bp处的启动子元件(图1)。

另外，在AcMNPV全基因组序列中，lef-10与下游基因vp1054有141 bp重叠，且位于vp1054上游523 bp处有3个TAAG基序[20]，而TAAG基序为晚期与极晚期基因启动子的重要元件。

图1 lef-10和vp1054顺式作用启动子元件

引物Ac-innateP-lef-10-F就是根据杆状病毒早期基因核心启动子元件的保守基序设计的，用引物Ac-innateP-lef-10-F和Ac-lef-10-R进行PCR扩增所得的片段包含了lef-10启动子和编码区的全部序列。

1.4.4 pTriEx-innateP-lef10-GFP重组质粒的构建 将innateP-lef10 PCR产物及构建好的pTriEx-lef10-GFP质粒均进行XbaⅠ、BamHⅠ双酶切，产物回收，将酶切好的PCR产物片段与切胶回收的载体大片段进行连接，16 ℃过夜连接，其余操作方法同1.4.2。将构建正确的重组质粒命名为pTriEx-innateP-lef10-GFP。

1.5 lef-10在Sf9细胞中的时空表达及定位

1.5.1lef-10在Sf9细胞中的表达定位分析 将构建好的pTriEx-lef10-GFP与Bacmid共转染Sf9细胞，获得重组病毒。转染步骤为：取0.5 mL离心管，向其中加入100 μL无菌水、5 μL构建好的质粒和3 μL线性化Bacmid，混匀后加入5 μL转染试剂，充分混匀，静置10～30 min后均匀加入到铺好的Sf9细胞中。转染4 d后收集上清病毒，然后取100 μL病毒重新感染Sf9细胞，3 d后，置于荧光显微镜下观察。

1.5.2 天然启动子控制下的lef-10在Sf9细胞中的时空定位分析 将构建好的pTriEx-innateP-lef10-GFP与Bacmid共转染Sf9细胞。转染步骤同1.5.1。转染4 d后，收集上清病毒用于后续试验。将Sf9细胞铺于6孔板平皿中，每孔感染100 μL重组病毒，感染4，8，16，24和36 h后收集细胞，经固定、抗体孵育及碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色。操作步骤如下：收集细胞于1.5 mL离心管中，200g离心15 min,弃上清；PBS洗3次，每次5 min，200g离心5 min，弃上清；质量分数4%多聚甲醛固定细胞15 min，200g离心5 min，弃上清；PBS洗2次，200g离心5 min，弃上清；用含有质量分数5%脱脂奶粉的PBS封闭30 min，200g离心5 min，弃上清；一抗37 ℃孵育2 h，200g离心5 min,弃上清；PBS洗3次，每次5 min，200g离心5 min，弃上清；二抗37 ℃黑暗孵育1 h，200g离心5 min，弃上清；PBS洗3次，每次5 min，200g离心5 min，弃上清；向细胞中加入PI(20 μg/mL)。取一干净载玻片，在其上滴1滴处理好的细胞悬浮液，盖上盖玻片，倒置，置于激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 lef-10 PCR扩增及重组质粒pTriEx-lef10-GFP的双酶切鉴定

以AcMNPV基因组为模板，通过PCR扩增lef-10基因，得到234 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图2-A)。将构建的重组质粒pTriEx-lef10-GFP经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后，得到约533 bp的片段(图2-B)，与预期片段大小相同，表明载体构建正确。

2.2 innateP-lef10 PCR扩增及重组质粒pTriEx-innateP-lef10-GFP的双酶切鉴定

以AcMNPV基因组为模板，通过PCR扩增innateP-lef-10基因，得到2 182 bp的特异性片段，大小与预期结果吻合(图3-A)。将构建的重组质粒pTriEx-innateP-lef10-GFP经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后，得到约2 204 bp的片段(图3-B)，与预期片段大小相同，表明载体构建正确。

图2 lef-10基因的PCR扩增结果(A)及重组质粒pTriEx-lef10-GFP的双酶切鉴定(B)

2.3 AcMNPV lef-10在Sf9细胞中的表达定位

由图4可见，在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白，由于lef-10和GFP形成的融合蛋白在强晚期启动子p10下共表达，所以观察到的绿色部分为lef-10和GFP形成的融合蛋白。从图4可以看到，在重组病毒感染Sf9细胞的晚期，表达的lef-10蛋白主要定位于细胞核，初步确定了其在宿主细胞内的定位情况。

图4 AcMNPV lef-10在Sf9细胞中的表达定位

2.4 天然启动子控制下的lef-10在Sf9细胞中的时空表达定位

为了进一步确定lef-10在Sf9细胞中的时空表达情况，本试验对天然启动子启动表达的lef-10进行了时空表达定位分析。在激光共聚焦显微镜下观察的结果(图5)显示，在重组病毒感染Sf9细胞的早期，即感染4 h，与GFP融合的lef-10已开始表达，但表达量较低；在向晚期时相过渡时期(即感染8 h后)，lef-10表达量增加并逐渐向细胞核转移，在晚期和极晚期时相，蛋白成簇聚集在细胞核中。据此推测，在病毒感染宿主细胞晚期，lef-10作为晚期表达因子在细胞核中发挥一定的功能，用于调控其他基因的转录；同时，也进一步证明试验早期核心启动子元件能够启动lef-10的早期表达。

图5 天然启动子控制下的lef-10在Sf9细胞中的时空表达及定位

3 讨 论

先前研究表明，无论在原核表达系统还是昆虫细胞表达系统中，lef-10都会形成一个巨大的复合物[21]。但由于得不到lef-10单体蛋白而无法获得抗lef-10的抗体，而GFP可以作为融合标签用于蛋白的亚细胞定位[22]，所以本试验将融合了GFP的lef-10蛋白用于亚细胞定位分析。

由于目前没有关于AcMNPVlef-10及其启动子的报道，为了尽量保留其启动子及有关旁侧序列，本试验在找到的核心启动子元件上游延伸了近180 bp，从而使lef-10能够得到完整表达。

在AcMNPV基因组中，polh基因表达的蛋白是形成病毒包涵体的主要蛋白，它对感染性病毒的产生及复制是非必需的[23]，所以在杆状病毒表达载体系统中，polh基因可以作为外源基因的插入位点。本试验构建的pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP载体可以与Bacmid发生重组，形成可以表达外源基因的重组病毒。

载体pTriEx-SP-GFP包含了可以在原核细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞及动物细胞中启动基因表达的3类启动子。本研究结果显示，pTriEx-lef10-GFP与Bacmid共感染Sf9细胞后，lef-10可以在载体自带的晚期强启动子p10的启动下进行表达；感染晚期，lef-10表达量较大且主要集中于细胞核中。

本试验分析了天然状态下的lef-10在宿主细胞中的表达定位情况，结果显示，在病毒感染细胞早期，lef-10就已开始表达，随着感染时间的推移，lef-10逐渐向细胞核移动，在晚期和极晚期时相，蛋白成簇聚集在细胞核中。这些结果也进一步说明，在受染细胞核中，lef-10是作为晚期表达因子发挥功能的，并且对其他基因的转录起一定的调控作用。

Lin等[24]和Durantel等[25]在研究AcMNPVlef-11和lef-4基因的表达及亚细胞定位时，利用anti-LEF-11和anti-LEF-4多克隆抗体，分析了在受感染细胞Sf9中lef-11和lef-4的表达水平及其在细胞中的定位，结果显示：lef-11和lef-4在病毒感染Sf9细胞的早期时相开始表达，且在晚期时相均定位在细胞核中，这与它们作为晚期表达因子行使功能是一致的；同时，2位学者还通过5′RACE、3′RACE及RT-PCR对它们的转录本进行了进一步分析。而在本试验中，由于抗体的限制，AcMNPV在感染Sf9细胞后,无法通过Western-blot方法对lef-10蛋白表达量进行分析,后续试验将在转录水平上通过对lef-10转录本进行分析，从而对lef-10的表达水平进行进一步验证。

4 结 论

本研究采用构建GFP融合标签的方法分析了lef-10在天然启动子控制下的表达及亚细胞定位情况，结果显示：lef-10在感染宿主细胞早期已开始表达，在晚期和极晚期时相，主要集中于细胞核中，推测lef-10对晚期其他基因的转录具有一定的调控作用。这为进一步研究lef-10的功能提供了一定的理论基础。

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