马引利,佘小平,闫 阅

(1 山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004；2 陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)

鞘脂是一类在许多真核生物的膜结构和机能中起重要作用、且普遍存在的膜脂。成熟鞘脂由1分子脂肪酸与1分子带有一个极性基团的长链碱基(LCB)以酰胺键结合而成[1]。哺乳动物中的LCB主要是鞘氨醇；而植物中的LCB有9种，主要是4,8-二烯醇和4-羟基-8-(神经)鞘氨醇的同分异构体，如植物鞘氨醇(Phyto-Sph)和二氢(神经)鞘氨醇[1]。LCBs的磷酸化是具有生物活性的鞘脂代谢物产生的一个重要过程。在真核生物中，LCBs由ATP依赖的LCB激酶(LCBKs)催化生成LCB-1P[2]，LCB-1P(如鞘氨醇-1-磷酸和植物鞘氨醇-1-磷酸)参与调节植物的许多重要的生理过程[3-8]。植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)是植物中一种主要的、Δ4饱和的LCBP(C-4和C-5之间无双键)，由鞘氨醇激酶(SphK)催化Phyto-Sph生成。前人的研究结果证明，Phyto-S1P是拟南芥保卫细胞脱落酸(ABA)信号转导途径中的重要信号分子[5-7]。ABA处理可显著提高拟南芥野生型SphK(一种LCBK)的活性，且Phyto-S1P介导ABA调控的气孔关闭；以拟南芥异三聚体G蛋白a 亚基基因GPA1敲除突变体为材料的研究显示，Phyto-S1P促进气孔关闭和抑制气孔开放的效应被阻断，这一结果表明，与在动物中一样，异三聚体G蛋白也是植物Phyto-S1P的下游靶分子[5]。鞘氨醇激酶1(SPHK1)已被证明参与ABA依赖的保卫细胞信号转导和种子萌发过程[6]。Guo等[7]报道，磷脂酶Dα1(PLDα1)/磷脂酸(PA)和SPHK/Phyto-S1P相互作用共同参与ABA调控的拟南芥气孔关闭。

胞内pH变化在植物许多生理过程中起重要作用[9-12]。胞质pH变化与气孔运动调节密切相关。保卫细胞胞质碱化介导ABA和茉莉酸甲酯(MJ)诱导的拟南芥、豌豆和兜兰的气孔关闭[9,12-14]。ABA可以提高兜兰保卫细胞胞质中游离Ca2+([Ca2+]cyt)的浓度，诱导胞质碱化[9]。胞质碱化与胞质Ca2+振荡在拟南芥保卫细胞ABA与MJ信号转导中协调发挥作用[15]。胞质碱化也可激活蚕豆保卫细胞外向K+电流，钝化内向K+电流，从而促进K+净流出[16]。另外，保卫细胞胞质酸化可介导激动素、吲哚乙酸(IAA)和壳梭孢素(FC)诱导的气孔开放[9]，并激活内向K+电流[17]。

一氧化氮(NO)作为一种普遍存在于生物体内的胞内和胞间信号分子，参与着多种生理过程[18]。Garcia-Mata等[19]首次证实，NO和气孔运动有关，外源NO能诱导气孔关闭；内源NO作为一种中间信号分子，在保卫细胞ABA信号转导过程中发挥作用[20]。另外，有研究显示，NO介导水杨酸[21]、暗条件[22]、UV-B[23]等调控的气孔运动。

目前，尚不清楚Phyto-S1P是否介导其他内、外因素，如暗条件对气孔关闭的影响，也未见关于Phyto-S1P是否参与暗诱导蚕豆气孔关闭的报道。为此，本研究借助气孔试验，利用基于NO特异荧光探针和pH特异荧光探针的激光共聚焦显微技术，对Phyto-S1P在暗诱导蚕豆气孔关闭中的作用及其与保卫细胞胞质碱化和NO产生的关系进行研究，旨在进一步了解Phyto-S1P在暗诱导气孔关闭中的作用及信号转导过程，也为完善暗调控气孔运动的信号转导途径积累资料。

1 材料与方法

1.1 试 剂

植物鞘氨醇-1-磷酸(Phyto-S1P)，购自Avanti Polar Lipids 公司；N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)，购自Merk(Germany)公司；NO特异荧光探针(DAF-2 DA)、pH特异荧光探针(BCECF-AM)、DL-threo-二氢鞘氨醇(DL-threo-DHS)、NO特异清除剂(cPTIO)、动物一氧化氮合酶(NOS)抑制剂(L-NAME)、2-(N-吗啡啉)乙烷磺酸(MES)、丁酸、二甲基亚砜(DMSO)，均购自Sigma-Aldrich (St Louis,MO)公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 植物材料处理

蚕豆(ViciafabaL.)种子购自汉中市种子公司。选取籽粒饱满的蚕豆种子，用质量分数0.1%的HgCl2灭菌10 min，自来水冲洗干净，于人工气候箱中催芽，待胚根长至1 cm左右时，播种于盛有湿沙的瓷盘中，于人工气候箱中培养。人工气候箱中光源为白色冷荧光灯管(Philips,New York,USA)，培养条件为：相对湿度80%、光强300 μmol/(m2·s)、温度(25±2) ℃、光/暗周期14 h/10 h。幼苗生长期间每天浇水1次，培养期间无任何水分胁迫。取生长3～4周蚕豆幼苗顶端完全展开的第1，2对叶片，撕取其下表皮，分割成约5 mm×5 mm的表皮条作为试验材料。

1.3 气孔开度的测定

气孔试验参照McAinsh等[24]的方法并稍作修改。

为研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME对暗诱导气孔关闭的效应，将新鲜撕取的蚕豆表皮条分别置于MES/KCl缓冲液(10 mmol/L MES/KOH，50 mmol/L KCl，100 μmol/L CaCl2，pH 6.15)中于光下(光强300 μmol/(m2·s)，光处理对照)和暗中处理(暗处理对照)3 h，同时在暗条件下将表皮条分别置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS(暗+DL-threo-DHS)、5 μmol/L DMS(暗+DMS)、200 μmol/L cPTIO(暗+cPTIO)和25 μmol/L L-NAME(暗+L-NAME)的MES/KCl缓冲液中，处理3 h，温度均为(25±2) ℃。

为研究外源Phyto-S1P对气孔开度的影响，将新鲜撕取的蚕豆表皮条置于含有不同浓度(0，2，4，6和8 μmol/L)Phyto-S1P的MES/KCl缓冲液(组成同前)中于光下处理3 h(对照)；或将Phyto-S1P于光下处理3 h后，再置于不含任何处理试剂的MES/KCl缓冲液中继续于光下处理3 h(洗脱试验)，光强均为300 μmol/(m2·s)，温度为(25±2) ℃。

为研究cPTIO和L-NAME对Phyto-S1P诱导的气孔关闭的抑制效应，将新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中(CK)，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、200 μmol/L cPTIO、25 μmol/LL-NAME及6 μmol/L Phyto-S1P和200 μmol/L cPTIO共处理(P+T)、6 μmol/L Phyto-S1P和25 μmol/LL-NAME共处理(P+L)的MES/KCl缓冲液中，于光下(300 μmol/(m2·s))处理3 h，温度为(25±2) ℃。

为研究丁酸对Phyto-S1P诱导气孔关闭的效应，将新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中，或置于含有6 μmol/L Phyto-S1P、不同浓度(0，0.5，1.0，1.5和 2.0 mmol/L)丁酸及6 μmol/L Phyto-S1P和不同浓度(0，0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L)丁酸共处理的MES/KCl缓冲液中，于光下(300 μmol/(m2·s))处理3 h，温度为(25±2) ℃。

上述处理结束后，用经台式测微尺标定的带目镜测微尺的光学显微镜分别测量气孔开度。气孔开度测量在每日的相同时间进行，以避免可能存在的气孔运动节律对测量结果的影响。每处理至少重复3次，每次随机测量30个气孔。试验数据以90个测量值的“平均值±标准误”表示。

1.4 保卫细胞NO和胞质pH的检测

以DAF-2 DA为探针测定保卫细胞NO水平，参照Kojima等[25]的方法并稍加修改。以DMSO(体积分数1%)为溶剂配制10 mmol/L的DAF-2 DA母液，4 ℃保存。以BCECF-AM为探针检测保卫细胞胞质pH，参照Irving等[9]的方法并稍做修改，以DMSO(体积分数1%)为溶剂配制1 mg/mL的BCECF-AM母液，-20 ℃保存。

为研究DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME对暗诱导保卫细胞NO生成的影响，以及cPTIO和L-NAME对Phyto-S1P处理引起的保卫细胞NO水平变化的效应，取新鲜撕取的蚕豆表皮条按照1.3节所述方法进行处理；为研究丁酸对暗诱导保卫细胞NO生成的效应，取新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中，于光下(光强300 μmol/(m2·s)，光处理对照)和暗中(暗处理对照)处理，同时将表皮条置于含有0.5 mmol/L丁酸的MES/KCl缓冲液中于暗中处理(暗+丁酸)，处理温度均为(25±2) ℃，处理时间均为3 h；为研究丁酸对Phyto-S1P处理引起的保卫细胞NO水平变化的效应，取新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P与0.5 mmol/L 丁酸共处理(P+B)的MES/KCl缓冲液中，于光下(300 μmol/(m2·s))处理3 h，温度为(25±2) ℃；上述处理结束之后立即将表皮条放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl(10 mmol/L Tris、50 mmol/L KCl、pH 7.2)装载缓冲液中，于(25±2) ℃下避光装载1 h。

为研究DL-threo-DHS和DMS对暗诱导保卫细胞胞质pH变化的效应，将新鲜撕取的蚕豆表皮条分别置于MES/KCl缓冲液中，于光下(300 μmol/(m2·s))和暗中处理，同时将表皮条置于含有15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS的MES/KCl缓冲液中于暗中处理，处理温度为(25±2) ℃，处理时间为3 h；为研究丁酸对Phyto-S1P处理引起的保卫细胞胞质pH变化的效应，取新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中(CK)，或置于含有0.5 mmol/L 丁酸、6 μmol/L Phyto-S1P及6 μmol/L Phyto-S1P和0.5 mmol/L 丁酸共处理(P+B)的MES/KCl缓冲液中于光下处理3 h，温度为(25±2) ℃；上述处理结束之后立即将表皮条放入含有20 μmol/L BCECF-AM的Tris-KCl装载缓冲液中，于(25±2) ℃避光装载10 min。为利于BCECF-AM的装载，加入质量分数0.05% Pluronic F-127于Tris-KCl 装载缓冲液中。装载完成后，用Tris-KCl装载缓冲液于暗中冲洗掉表皮条表面的多余探针，立即以TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜(Leica Lasertechnik Gmbh,Heidelberg)进行检测。共聚焦显微镜的检测参数设置为：激发波长488 nm，发射波长505～530 nm，常规扫描速度。所得图像用Leica Image Software和Photoshop 7.0进行分析。

为了检测Phyto-S1P导致的保卫细胞NO水平和胞质pH变化的时间进程，将新鲜撕取的蚕豆表皮条置于MES/KCl缓冲液中，于光下(光强300 μmol/(m2·s))处理3 h以使气孔开放，然后立即将表皮条放入含有10 μmol/L DAF-2 DA的Tris-KCl装载缓冲液中，避光装载1 h，同时将表皮条放入含有20 μmol/L BCECF-AM和质量分数0.05% Pluronic F-127的Tris-KCl装载缓冲液中，避光装载10 min，装载温度为(25±2) ℃；以Tris-KCl装载缓冲液冲洗掉表皮条表面的多余探针后，用Tris-KCl装载缓冲液孵育表皮条并将 Phyto-S1P(终浓度6 μmol/L)直接加入该缓冲液中，然后用共聚焦显微镜(参数同上)检测30 min内保卫细胞DAF-2 DA和BCECF-AM荧光的变化。

所有样品的共聚焦图像均在同一条件(手动设置)下采集。每次处理检测3个表皮条，每处理至少重复3次。

1.5 统计分析

所有试验数据用One-way ANOVA进行差异显著性分析，用Duncan法进行多重比较，以P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 Phyto-S1P诱导保卫细胞NO产生与其介导暗诱导气孔关闭的关系

She等[22]的研究显示，保卫细胞NO水平升高为暗诱导气孔关闭的必需条件。为探明Phyto-S1P是否介导暗诱导蚕豆气孔关闭，以及暗诱导气孔关闭期间Phyto-S1P与NO产生是否有关，本研究检测了DL-threo-DHS和DMS(哺乳动物中LCBK的2种抑制剂)对暗诱导气孔关闭和保卫细胞NO水平升高的效应。图1结果显示，在暗培养条件下，与光处理相比，15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS显著抑制暗诱导的气孔关闭(P<0.05)，且与cPTIO、L-NAME的效应相似。与光处理(图2-A，G)相比，暗处理诱导保卫细胞产生了强烈的DAF-2 DA荧光(图2-B，G)；而4种试剂均对暗处理DAF-2 DA荧光的产生有一定抑制作用(图2-C，D，E，F，G)。由DL-threo-DHS和DMS抑制暗诱导气孔关闭和NO产生的结果可以得出，Phyto-S1P可能通过诱导NO产生介导暗诱导的气孔关闭。

为进一步证明Phyto-S1P通过诱导NO产生介导暗诱导气孔关闭，本研究检测了外源Phyto-S1P对气孔开度和NO产生的效应。结果显示，≥4 μmol/L的Phyto-S1P可显著诱导气孔关闭(P<0.05)，6 μmol/L为最适浓度；洗脱试验结果显示，Phyto-S1P对气孔开度的效应可以逆转，而不是由不可逆的细胞毒性引起的(图3-A)。Phyto-S1P诱导的气孔关闭和NO产生可被cPTIO和L-NAME显著阻止(P<0.05)(图3-B，C)。这些结果进一步证实，Phyto-S1P通过诱导NO产生介导暗诱导气孔关闭。

图1 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME对暗诱导气孔关闭的影响

图2 DL-threo-DHS、DMS、cPTIO和L-NAME对保卫细胞NO产生的影响

2.2 Phyto-S1P提高保卫细胞胞质pH与其参与暗诱导气孔关闭的关系

要确定Phyto-S1P在暗诱导气孔关闭中的作用，需研究暗诱导气孔关闭期间Phyto-S1P与胞质pH变化的关系，本研究首先分析了DL-threo-DHS和DMS对暗诱导胞质pH变化的效应。结果显示，与光处理(图4-A，E)相比，暗处理可以显著提高保卫细胞胞质pH水平(P<0.05)(图4-B，E)；而暗诱导的保卫细胞胞质pH升高可被15 μmol/L DL-threo-DHS和5 μmol/L DMS显著抑制(P<0.05)(图4-C，D，E)。由此可以得出，Phyto-S1P可能通过提高保卫细胞胞质pH水平参与暗诱导气孔关闭。

为进一步证实暗诱导气孔关闭中Phyto-S1P的作用及其与保卫细胞胞质pH升高(胞质碱化)的相关关系，本研究检测了丁酸(常用以调节保卫细胞胞质pH[14])对外源Phyto-S1P诱导气孔关闭和保卫细胞胞质pH变化的效应。结果显示，外源Phyto-S1P显著诱导气孔关闭(P<0.05)，而≥0.5 mmol/L 丁酸处理对Phyto-S1P诱导的气孔关闭有显著抑制效应(P<0.05)(图4-F)。与对照(CK)相比，Phyto-S1P可显著诱导保卫细胞胞质碱化 (P<0.05)，而0.5 mmol/L丁酸可显著抑制Phyto-S1P诱导的胞质pH升高(P<0.05)，且丁酸单独处理对保卫细胞胞质pH无明显抑制效应(P>0.05)(图4-G)。这些结果进一步证实，Phyto-S1P通过诱导保卫细胞胞质碱化参与暗诱导气孔关闭。

图3 cPTIO和L-NAME对外源Phyto-S1P诱导的气孔关闭和保卫细胞NO产生的影响

图4 Phyto-S1P参与暗诱导气孔关闭过程中pH的变化

2.3 暗诱导气孔关闭期间Phyto-S1P诱导的保卫细胞胞质碱化与NO产生的关系

在证实Phyto-S1P通过诱导保卫细胞NO产生和提高胞质pH介导暗诱导气孔关闭的基础上，需进一步探明Phyto-S1P诱导的胞质pH升高与NO产生的关系。试验结果显示，与光处理相比，暗处理可以显著诱导NO产生(P<0.05)，而暗诱导NO产生的效应可被丁酸显著抑制(P<0.05)(图5-A)。结合前文得到的Phyto-S1P诱导的胞质pH升高和NO产生均参与暗诱导气孔关闭的结果(图1,2，3和 4)，可以推断，暗诱导气孔关闭期间Phyto-S1P引起的胞质碱化是NO产生的先决条件。

图5 Phyto-S1P诱导的保卫细胞胞质碱化与NO产生的关系

试验结果(图5-B，C)还显示，对照保卫细胞胞质pH和NO水平在30 min内未见明显变化；外源Phyto-S1P处理6 min时保卫细胞胞质pH显著升高(P<0.05)，处理18 min时达到最大值(图5-B)；而Phyto-S1P处理8 min时NO水平才开始显著升高(P<0.05)，于处理24 min时达到峰值(图5-C)。同时，丁酸显著抑制外源Phyto-S1P诱导的NO产生(P<0.05)(图5-D)。这些结果进一步证明了暗诱导气孔关闭中Phyto-S1P诱导的胞质碱化是NO产生的先决条件的推断。

3 讨 论

鞘脂是膜脂的主要成分，鞘脂代谢物S1P和Phyto-S1P是保卫细胞ABA信号转导途径中的重要信号分子[3-8]。目前，Phyto-S1P和SPHK已被证明参与ABA调控的拟南芥气孔运动[5-7]。本研究结果显示，暗处理可以诱导蚕豆气孔关闭，外源Phyto-S1P可以模拟暗处理对气孔开度的影响效应，暗诱导的气孔关闭可被LCBK抑制剂DL-threo-DHS和DMS显著抑制。由于LCBK也可以磷酸化鞘氨醇，且S1P也能促进蚕豆和拟南芥气孔关闭[3-4,8]，故本试验结果不排除S1P参与暗诱导气孔关闭的可能性[8]。

已有的研究结果显示，Phyto-S1P和NO均参与ABA诱导的气孔关闭[5,7,20,26]。本研究结果显示，外源Phyto-S1P可以模拟暗效应诱导NO产生。DL-threo-DHS和DMS对暗诱导的NO产生有显著的抑制效应。这些结果表明，Phyto-S1P通过诱导保卫细胞NO产生介导暗诱导蚕豆气孔关闭。另外，Phyto-S1P诱导的NO产生可被L-NAME显著抑制，暗示其类似NOS负责催化Phyto-S1P诱导的气孔关闭过程中的NO产生。

pH在植物很多生理反应包括气孔运动中具有重要的信号转导作用[8,10-11,14]。降低保卫细胞胞质pH的效应剂(如IAA和FC)可促使气孔开放[9]，而提高保卫细胞胞质pH的效应剂(如ABA和MJ)则促进气孔关闭[12,16]。前人的研究结果显示，ABA和MJ诱导的气孔关闭中，保卫细胞胞质碱化发生于NO产生之前[14,27]。然而，尚不清楚Phyto-S1P是否通过影响胞质pH进而调控气孔运动。本研究结果显示，DL-threo-DHS和DMS可显著抑制暗诱导的保卫细胞胞质pH升高和气孔关闭，而外源Phyto-S1P可模拟暗处理显著诱导保卫细胞胞质pH升高和气孔关闭。此外，Phyto-S1P对胞质pH和气孔开度的效应可被丁酸显著抑制。以上结果表明，Phyto-S1P通过引起保卫细胞胞质pH升高(胞质碱化)参与暗诱导蚕豆气孔关闭。

虽然已经清楚保卫细胞胞质碱化是ABA和MJ诱导NO产生和气孔关闭中的一个早期事件[14,27]，但尚不清楚暗诱导气孔关闭中胞质碱化是否为NO产生的诱因。本研究显示，暗诱导保卫细胞NO产生可被丁酸显著抑制，结合本研究得到的暗处理显著诱导保卫细胞胞质碱化、NO产生和气孔关闭的结果，由此可以推断，暗诱导气孔关闭期间保卫细胞胞质碱化是NO产生的诱导因素；而外源Phyto-S1P处理后，胞质pH升高较NO水平增加的滞后期更短且达到峰值更早，且外源Phyto-S1P诱导的保卫细胞NO产生可被丁酸显著抑制，这些结果进一步证实了该结论。

4 结 论

Phyto-S1P参与了暗诱导蚕豆叶片气孔关闭的信号转导过程，且其是通过提高保卫细胞胞质pH和NO水平介导暗诱导的蚕豆气孔关闭过程，保卫细胞胞质pH升高是NO产生的诱导因素。

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