余树民，凌占业,2，刘 丹，刘欢欢，夏 娟，沈留红，曹随忠，左之才，邓俊良，任志华，马晓平，王 娅，胡延春

(1 四川农业大学 动物医学院，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，四川 雅安 625014；2 河南省黄泛区鑫欣牧业有限公司，河南 周口 466632)

Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1是干细胞自我更新和多潜能性的关键调控因子[1-2]，常与胚胎阶段特异性抗原(Stage-specific embryonic antigen,SSEA)SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4一起被用作鉴定胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)[3]、胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EG)[4-5]等多潜能细胞的标志分子。近年来，有许多关于上述标志分子在不同组织器官来源的成体干细胞(Somatic stem cells,SSCs)中表达的研究报道，如性腺[6-7]、骨髓[8-9]、脂肪[8]、皮肤[8]、血液[10]、脐带[11-16]等，因此许多学者将这些干细胞“干性”标志分子用于评价成体干细胞的多潜能性。脐带是妊娠时连接母体和胎儿的管状器官。近年来的研究表明。脐带是获取胎儿干细胞的最适来源之一，利用脐带分离干细胞具有来源丰富、不需要手术取样和损伤小等优点，且分离成功率可达100%，明显优于骨髓、脐血和脂肪[17-18]；脐带来源细胞增殖能力旺盛，呈现碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性和高端粒酶活性，表达早期胚胎细胞标志分子[11-16，18]。

猪不仅是一种与人类生活息息相关的重要经济动物，而且是人类异种器官移植的理想来源。多潜能干细胞是猪基因改造和组织器官发育研究的重要起始材料。已有研究显示，以分化程度低的干细胞作为细胞核移植供核细胞能显著提高重构胚囊的胚形成率[19-20]。Carlin等[11]报道，猪脐带来源细胞具有碱性磷酸酶和端粒酶活性，表达Oct4、Nanog和Sox2，体外培养可形成ES样细胞集落。基于此，本试验以猪脐带为材料，从基因转录和蛋白水平研究SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct4、Nanog、Sox2和Rex-1的表达，以期为猪脐带的利用及其来源细胞在转基因技术中更好地发挥作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 猪脐带采自四川某规模化猪场三元杂交(长白×大白×杜洛克)种猪足月分娩的仔猪，共采集脐带20份；hES-18细胞RNA由西北农林科技大学国家干细胞工程技术中心陕西分中心华进联教授惠赠，作为试验阳性对照；Hela细胞由四川农业大学动物医学院动物生物技术中心保存，作为试验阴性对照。

1.1.2 主要试剂 免疫组化用一抗为兔抗人Nanog和Sox2多克隆抗体，以及鼠抗人 Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4单克隆抗体等，免疫组化用二抗为通用羊抗兔和羊抗鼠抗体，以及显色试剂盒等，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。分子生物学实验用试剂焦碳酸二乙酯 (DEPC)、DNA Marker、RNA保存液、总RNA抽提试剂盒(Simple total RNA Kit)和PCR 2×Master Mix等，购自北京天根生化科技有限公司。PMD19-T Simple Vector、PrimeScript®RT reagent Kit等，购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.3 引物设计与合成 以GenBank收录的基因Oct4(GenBank登录号：DQ486513)、Nanog(GenBank登录号：AY230262)、Sox-2(GenBank登录号：Z31560)、Rex-1(GenBank登录号：AF450454)和β-actin(GenBank登录号：DM_001101.3)的cDNA序列为模板，利用Primer 5.0软件设计引物，引物序列和产物长度详见表1。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 脐带组织总RNA的抽提 将猪脐带样品用无RNA酶磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗去除血凝块与污物，剪碎，用RNA冻存液-20 ℃保存备用。试验时，按RNA 抽提试剂盒说明书分别抽提脐带组织和Hela细胞(阴性对照)的总RNA。

1.2.2 RT-PCR检测分析和扩增片段测序 按照PrimeScript®RT试剂盒说明书分别将各样品总RNA(包括Hela细胞)及hES-18细胞RNA(阳性对照)反转录为cDNA，再取cDNA按下述反应条件在PCR仪(型号MyCycler，美国BIO-RAD)上进行PCR反应，检测各样品中基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1和β-actin的转录情况，以β-actin作为内参照。PCR反应体积均为20 μL，包括2×PCR Master Mix 10 μL、样品cDNA 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL和双蒸水6 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性35 s，按表1所示温度退火35 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应完毕，扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶上电泳(90 mV，30 min)，凝胶成像仪(型号GelDoc 2000，美国BIO-RAD)观察并记录电泳图像。试验重复3次。利用Quantity One软件将电泳图像中各目的条带的灰度值换算为具体数值，其与β-actin电泳条带灰度值的比值即为目的基因在样品中的mRNA相对表达量，计算公式为：目的基因mRNA相对表达量=目的基因条带灰度值/β-actin基因条带灰度值。

用DNA回收试剂盒分别回收脐带组织基因Oct4、Nanog、Sox2、Rex-1的PCR扩增片段，将其与测序载体PMD19-T连接，送华大基因有限责任公司测序。用Blasta软件将测序结果分别与相应基因的引物设计模板(见1.1.3)进行同源比对。

表1 检测基因的引物序列、退火温度和产物长度

1.2.3 脐带组织的免疫组化分析 将猪脐带样品浸入40 mL/L多聚甲醛溶液中固定，经常规冲洗、脱水、透明化、石蜡包埋、切片、烘片等程序制作组织切片，备用。部分切片经苏木精/伊红(HE)染色，观察组织形态结构，其中细胞核会被染成蓝色，胞浆染为红色。

免疫组化染色用于鉴定干细胞标志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原在脐带组织中的表达。Oct4、Nanog和Sox2作为一抗进行免疫组化染色时，需对组织切片进行抗原修复，其余操作与SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4作为一抗的试验操作相同，均按SP免疫组化试剂盒说明书进行操作，即将切片或经抗原修复的切片用双氧水处理，然后分别与一抗孵育，4 ℃过夜，清洗，再根据所用一抗加入羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育，清洗后滴加显色试剂DAB显色，漂洗后脱水透明，于显微镜下观察照相，组织切片背景为微黄色或无色，反差强而能辨认即进行判定，切片中呈棕褐色、棕黄色、棕红色的为阳性细胞，说明该细胞表达一抗对应的蛋白抗原。其中，Oct4、Nanog和Sox2为核蛋白抗原，SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4为胞浆或膜抗原，免疫组化染色切片未进行复染。

1.3 统计学分析

所得试验数据用“平均值±标准差(x±SD)”表示，用SPSS 13.0软件进行方差分析，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 猪脐带组织中干细胞“干性”调控关键转录因子基因的RT-PCR

RT-PCR结果显示，从20份脐带样品中均扩增出干细胞“干性”调控关键基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1(部分样品扩增结果见图1)的目的条带；用同一引物和相同的PCR扩增条件也显示，阳性对照hES-18细胞强阳性表达基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1，阴性对照Hela细胞不表达这4个基因(见图1)；将脐带组织基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的PCR扩增片段分别回收并进行测序，显示各基因扩增片段序列与其模板(GenBank登录号分别为NR_002304、NM_024865、NM_003106和NM_174900)的同源性分别为98%，99%，100%和98%。该结果说明，本试验所用引物及反应条件特异扩增了各个目的基因，猪脐带组织转录表达干细胞“干性”调控关键基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1。

由表2可知，NanogmRNA相对表达量显著低于Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA，而Oct4 mRNA、Sox2 mRNA和Rex1 mRNA的相对表达量无显著性差异。

图1 猪脐带部分样品中Oct4、Nanog、Sox2和Rex1基因表达的RT-PCR电泳结果

表2 猪脐带组织中基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1 mRNA的相对表达量

2.2 猪脐带组织中胚胎干细胞标志分子表达的免疫组化分析

以Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4为一抗的免疫组化分析结果如图2所示，试验脐带样品的统计结果见表3。由图2和表3可知，75%以上猪脐带样品阳性表达Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4蛋白抗原，阳性细胞不同程度地被染成棕褐色、棕红色或棕黄色；Nanog呈阳性染色的样品数量明显较Oct4、Sox2、SSEA-1多，但在组织切片上其着色强度明显较后三者弱，而Sox2、SSEA-1的着色程度明显强于Oct4、Nanog、SSEA-3和SSEA-4。图2还显示，阳性细胞主要分布于临近血管的华通氏胶区域，细胞多为椭圆形和圆形，多数单个散在，也有少数成簇聚集。组织切片H/E染色结果(图2)显示，血管周围及华通氏胶区域分布较多单个散在的小细胞，这类细胞呈苏木精深染。

图2 猪脐带组织HE染色及其免疫组化分析

表3 多潜能细胞标志分子在猪脐带组织中表达的免疫组化检测(n=20)

3 讨 论

尽管有报道指出，脐带源原代细胞能形成ES样细胞集落，但传代后均呈纤维样细胞形态[12-13]。而目前从脐带分离的主要是间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)，虽已有一些关于脐带来源细胞表达ES细胞标志分子的研究报道，但其结果并不完全一致。在人上，Jo等[12]和Fong等[13-14]分别报道脐带源MSC表达Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但关于SSEA-1、SSEA-3表达的结果却不尽一致；Carlin等[11]、Lee等[16]分别报道猪和犬的脐带基质细胞表达Nanog、Oct4、Sox2，其中犬脐带基质细胞还表达SSEA-4。Hoynowski等[15]报道，马脐带基质细胞表达Oct4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、c-Kit、CD133和C-myc。综观以上研究，其均以体外培养的细胞为材料，而不同培养条件会使基因表达呈现不同的特点[21-22]，所以体外培养的细胞不一定能真实反映脐带组织的基因表达状况。本试验中，RT-PCR和免疫组化分析结果显示，猪脐带组织在基因转录和蛋白质水平均表达Oct4、Nanog、Sox2，同时也转录表达Rex-1 mRNA，结果与Carlin等[11]、Jo等[12]、Fong等[13-14]和Lee等[16]的结果一致；免疫组化分析结果还显示，猪脐带组织表达SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4抗原，与Jo等[12]、Fong等[13-14]、Hoynowski等[15]以及Lee等[16]的结果部分一致，SSEA表达特点与Tsung等[23]报道的猪胚胎生殖细胞一致，提示脐带可能存留有未分化原始生殖细胞。本试验中，猪脐带组织切片的H/E染色结果显示，临近血管的华通氏胶区域分布有较多体积小且以胞核着色为主的细胞，但目前还未见从脐带获得类ES细胞或EG细胞的报道；另外，脐带来源MSC所表现的早期未分化干细胞特点是其本身所为，还是因为其中含有多潜能性早期胚胎细胞，或者含有最近报道的极小胚胎样干细胞(Very small embryo-like cells, VSEL)[24]，尚需要进一步研究。

有研究指出，Oct4并不是SSCs自我更新和多能性维持所必需的转录因子[9，25]，Nanog是人MSC多潜能调控因子[9]。Arnold等[26]指出，Sox2是早期胚胎、胎儿和出生后个体等不同发育阶段各类型干细胞或未成熟前体细胞共同表达的标志分子，是机体各种干细胞/前体细胞自我更新和保持分化潜能所必需的内源性转录因子。本试验结果显示，不管是基因转录水平还是蛋白水平，Sox-2均呈现高表达，根据Arnold等[26]的结果推断，这可能与脐带再生有关；另外，笔者注意到Oct4 mRNA表达量与Sox-2 mRNA差异不显著，但免疫组化分析结果显示其呈弱表达，这一差异可能与部分Oct4 mRNA无翻译功能有关，或者是Oct4表达假基因的结果，因为有报道指出，在很多情况下Oct4存在假基因表达的现象[27]。

本研究在mRNA转录和蛋白水平上证实，多潜能性细胞标志分子Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4在猪脐带组织中表达，SSEA表达特点与猪胚胎生殖细胞一致，提示猪脐带组织中可能含有早期未分化的多潜能细胞。

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