王 琛，刘雪兰，陈芳芳，余为一

(安徽农业大学 安徽省人兽共患病重点实验室，安徽 合肥230036)

肽疫苗具有特异性强、安全、有效等特点，目前已经应用于癌症、糖尿病等疾病的治疗[1-2]，构建具有增强抗原递呈免疫载体的嵌合体肽疫苗无疑是一种提高治疗效果的有效方法。恒定链(Invariant chain，Ii)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，呈非多态性[3-4]，作为MHCⅡ类分子伴侣蛋白，在递呈外源性抗原的过程中发挥着重要作用。Ii的CLIP片段占据MHCⅡ类分子内的肽结合区凹槽，阻止内源性多肽的结合[5-6]；当外源性抗原肽进入时，凹槽中的CLIP片段被酶解，抗原肽进入凹槽并被递呈到细胞表面，以便被CD4+Th细胞识别，从而激活免疫应答[7]。

用抗原肽取代Ii的CLIP片段的嵌合体，其抗原肽占据MHCⅡ类分子“凹槽”，优先进入MHCⅡ类分子输运呈递途径，不仅可增强抗感染免疫，还可以改变异常免疫应答的性质[8]。Adams等[9]报道，用Ii关键基团Ii-key结构(即四肽LRMK，与CLIP区N端相连)与抗原肽连接构建的嵌合体具有免疫增强作用。目前，Ii-key结构成为重要的免疫载体，并在多肽疫苗中得到了应用[10-13]。此外，用小鼠Ii跨膜区(Cyt)、胞浆区(Tm)的功能片段连接抗原肽免疫小鼠，能够增强免疫效应[14]。但是尚不清楚Ii这些功能片段的作用是否具有跨物种的限制。为此，本研究构建了基于鸡Ii功能片段和新城疫病毒(NDV)的F306肽段中第二个抗原表位(即F2片段[15])的多个嵌合体，用其免疫小鼠，通过细胞共定位和抗体水平研究鸡Ii活性片段在小鼠体内的免疫效果，以期为构建跨物种免疫载体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

COS-7细胞、Rosetta(DE3)以及DH5α均由安徽省人兽共患病重点实验室保存；限制性内切酶、DL 2000 Marker、T4 DNA连接酶以及Premix ExTaq购自宝生物工程有限公司；小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等均购自OMEGA生物工程公司。用激光共聚焦显微镜(FV1000)的60×油镜分别观察红色荧光(488 nm)和绿色荧光(515 nm)。

1.2 试验动物

8周龄昆明系雌性小白鼠，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.3 嵌合体的构建

根据鸡Ii链以及新城疫病毒F蛋白结构，以安徽省人兽共患病重点实验室保存的重组质粒pGEX-4T-1-F306、pEGFP-C1-Ii为模板，根据质粒的酶切位点和目的基因片段序列，自行设计7对引物(表1)，由宝生物工程有限公司合成。采用PCR法构建嵌合体Ii-F2、Cyt/Tm/Ii-key/F2/Ap、Tm/Ii-key/F2/Ap、Ii-key/F2/Ap和Ii-key/F2，其结构见图1。PCR反应体系为TaqBuffer(Mg+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、引物F 1.0 μL、引物R 1.0 μL、pEGFP-C1-Ii 0.5 μL和RTaq0.5 μL，加ddH2O至终容积150.0 μL；反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃热变性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃ 8 min， 4 ℃终止反应。

表1 基因片段与嵌合体引物序列

图1 嵌合体结构示意图

将各嵌合体片段分别插入pET-32a、pGEX-4T-1载体，构建重组质粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2、pET-32a-F2和pGEX-4T-1-F2，将其转化至E.coliRosetta(DE3)工程菌中，然后将转化后的菌株送上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定；同时，提取重组质粒用BamHⅠ/SalⅠ进行双酶切鉴定。PCR扩增产物和双酶切产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 嵌合体抗原的制备与小鼠免疫

将上述1.2节中获得的重组菌加入适量的IPTG(终浓度为1.0 mmol/L)，振荡培养5 h。用超声波破碎菌体(180 W超声5 s，间隔10 s，36个循环)，经Native-PAGE电泳后，按于在江等[16]的方法用0.25 mol/L KCl切胶法纯化融合蛋白，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定。

将试验小鼠随机分为6个试验组和1个对照组，每组3只，6个试验组小鼠分别用纯化的His-Ii-F2、His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、His-Tm/Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2/AP、His-Ii-key/F2和His-F2融合蛋白腹腔注射免疫约100 μL/只，免疫剂量为50 μg/只。对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。常规免疫5周后眼球采血，收集血清，于-20 ℃保存备用。

1.5 抗体检测

采用间接ELISA法检测嵌合体抗体效价，以重组质粒pGEX-4T-1-F2表达的GST-F2融合蛋白作为抗原包被酶标板。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，最后以邻苯二胺(OPD) 进行显色反应，室温放置10～15 min后终止反应，用酶标仪检测492 nm 波段的吸光值，并对所得数据进行统计学分析。每个样品重复3孔。

1.6 真核载体的构建、转染及共定位观察

为探究鸡Ii是否能与小鼠MHCⅡ类分子结合，本试验还用含鸡Ii基因的重组真核表达质粒pmCherry-C1-Ii，以及含增强型绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠MHCⅡα链、β链的pEGFP-MHCⅡα和pEGFP-MHCⅡβ的重组真核表达质粒，经LipofectamineTM2000共转染COS7细胞[14]，转染48 h后置于激光共聚焦显微镜(Zeiss)下，观察鸡Ii与小鼠MHCⅡα、β链的共定位情况。

2 结果与分析

2.1 Ii功能片段-抗原肽嵌合体的鉴定

图2显示，嵌合体的PCR扩增获得了710 bp的Ii、692 bp的Ii-F2、374 bp的Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、300 bp的Tm/Ii-key/F2/AP、152 bp的Ii-key/F2/AP、146 bp的Ii-key/F2、128 bp的F2，重组质粒pET-32a-Ii、pET-32a-Ii-F2、 pET-32a-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Tm/Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2/AP、pET-32a-Ii-key/F2和pET-32a-F2经BamHⅠ/SalⅠ双酶切，均获得了预期长度的目的片段。测序结果显示，所有克隆的DNA序列与模板序列一致。该结果表明，本试验成功地构建了Ii功能片段的嵌合体。

2.2 嵌合体融合蛋白的纯化

对纯化的嵌合体融合蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。图3结果显示，在44.7(His-Ii-F2)，33.2(His-Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP)，29.2(His-Tm/Ii-key/F2/AP)，24.4(His-Ii-key/F2/AP)，24.0(His-Ii-key/F2)和23.8(His-F2)ku处有相应的目的条带，大小与预期结果相符。

2.3 Ii功能片段诱导的抗体水平

用pGEX-4T-1-F2重组质粒表达的带GST标签的GST-F2融合蛋白作为包被抗原，经间接ELISA检测，结果(图4)显示，对照组小鼠抗F2抗体效价约为(0.7±0.06)×104，而Ii-key/F2、Ii-key/F2/AP、Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、Tm/Ii-key/F2/AP和Ii-F2融合蛋白免疫组抗F2的抗体水平为1.2×104～2.2×104，分别为对照组的1.5，2.5，3，3和3倍。这表明以鸡Ii功能片段为载体构建的嵌合体在小鼠体内均具有不同程度的免疫增强作用。

图2 嵌合体的PCR扩增及其重组质粒的BamHⅠ/SalⅠ双酶切鉴定

图3 纯化后嵌合体融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测

2.4 鸡Ii与小鼠MHCⅡ类分子的共定位

激光共聚焦显微镜观察结果(图5)表明，在细胞相同位置共定位的蛋白分子会形成橙色荧光。该结果说明，鸡Ii与鼠MHCⅡ类分子能在细胞膜上共定位，表示两者具有相互作用。

3 讨 论

MHCⅡ类分子的多态性是动物与病原长期选择的结果，MHCⅡ分子与抗原肽之间的亲和力大小与抗原递呈效应密切相关[17]。Ii作为MHCⅡ分子的重要伴侣，在其递呈抗原过程中起重要的辅助作用。Kim等[18]用人乳突淋瘤病毒(Human papilloma virus，HPV-16)抗原肽E6、E7连接Ii共免疫小鼠，增强了特异性CD8+T淋巴细胞的免疫应答，提高了小鼠存活期。Zinckgraf等[19]用禽流感病毒H5N1的HA抗原表位与人Ii-key连接后对志愿者免疫，发现其免疫效果较单一抗原免疫增强了3～10倍。Voutsas等[20]研究发现，Ii-Key/HER-2/neu 776-790aa嵌合体多肽能够诱导促进细胞增殖并增强CD4+T淋巴细胞的应答，还能明显增强特异性CD8+T淋巴细胞的细胞毒作用[21]，而且特异性抗体水平也有明显提高[22]。

图5 鸡Ii与小鼠MHCⅡ类分子在COS7细胞中的共定位

鸡恒定链与人和小鼠等哺乳动物Ii存在约60%的同源性，主要的功能区序列保守。本研究通过激光共聚焦显微镜观察发现，鸡的Ii能够与小鼠MHCⅡα或β链在COS7细胞内共定位，并且经过体内试验证明，用鸡Ii-key及其活性片段携带抗原肽免疫小鼠能够增强特异性体液免疫应答水平。对于免疫增强的效果，各个功能片段所起的作用并不相同：鸡恒定链CLIP区N端的Ii-key结构能够促进抗原肽与MHCⅡ分子的结合，而N端的胞浆区、跨膜区和C端的AP结构均能起到辅助作用，可进一步增强免疫效果。此外，有研究还表明，鹌鹑Ii与鸡和小鼠的MHCⅡα或β链也存在跨越种间的相互作用[23]。上述结果表明，尽管禽类与哺乳动物Ii之间存在序列上的差异，但是作为MHCⅡ分子伴侣的Ii，在禽类与哺乳动物中均维持相似的功能特性，而且异种Ii可以跨越物种限制。此外，Ii具有可连接多种抗原肽的潜力，并且可以不使用免疫佐剂[2]，这为Ii成为跨物种抗原肽载体的结构基础提供了依据。但是不同物种，如哺乳动物与禽类的Ii，尤其是Ii-key氨基酸序列存在明显不同，选择何种Ii功能片段作为免疫载体最为有效，还有待于进一步研究。

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