蔡 欣，泽让东科，赵芳芳，孙 磊

(1 西南科技大学 生命科学与工程学院,四川 绵阳 621010;2 西南民族大学 生命科学与技术学院,四川 成都 610041)

我国牦牛的数量和类群居世界之冠，约占世界牦牛总数的95%以上[1]。多年以来，牦牛的育种工作由于种种原因裹足不前，而缺乏可靠稳定的分子遗传标记是重要的原因之一。微卫星(Microsatelite)已被广泛应用于群体遗传研究、生物遗传作图、个体间亲缘关系鉴定等方面，但是目前尚未见将牦牛自身基因组微卫星标记应用于牦牛群体遗传的报道，研究人员只能利用普通牛的微卫星序列分析牦牛的群体遗传结构特征和系统分类[2-5]。由于普通牛与牦牛分属于不同的物种，其基因组内功能基因编码序列常存在明显的不同，微卫星序列应该亦存在较大差别，所以以普通牛基因组微卫星研究牦牛群体或个体之间的遗传多态性，不仅难度较大，而且研究结果的准确性和可重复性应该远远低于用牦牛自身基因组微卫星的研究结果。本课题组通过Dynal磁珠富集从牦牛基因组中分离出59个具有(AC)n/(GT)n串联重复序列的微卫星位点，将为牦牛遗传多态性研究、遗传连锁图谱构建以及分子育种提供一些分子标记[6]。本研究进一步利用其中多态性较好的4个新微卫星位点对麦洼牦牛群体的遗传多态性进行分析，以期为麦洼牦牛遗传分化特征研究和遗传资源挖掘提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

从四川省红原县麦洼牦牛原种群繁育基地和当地屠宰场中随机选取130头个体作为研究对象，采取每个个体的静脉血、耳组织块或毛发样品，处理后低温送回实验室保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 牦牛基因组DNA的提取 麦洼牦牛血液基因组DNA按照Cai等[7]所用方法提取，耳组织和毛发样品基因组DNA按照常规的“盐析法”进行提取，确保高纯度且无蛋白和RNA污染，选择提取质量较好个体的DNA样品用作微卫星扩增模板。

1.2.2 微卫星标记 4个新的微卫星标记(Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215)的核心重复序列、PCR扩增引物以及退火温度如表 1所示。

表1 4个微卫星位点的基本信息

通过Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京梓熙生物科技有限公司合成，Bogr203、Bogr204和Bogr215位点PCR扩增上游引物5′端均用FAM荧光染料标记，而Bogr205位点PCR引物5′端用HEX荧光染料标记。

1.2.3 微卫星标记的PCR扩增 以上述130个牦牛个体基因组DNA为模板，对各个位点分别进行PCR扩增。PCR反应总体系为25 μL，其中10×Buffer (Mg2+free) 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4 μL，微卫星位点扩增上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶 (5 U/μL) 1.25 μL，模板DNA 1 μL，超纯灭菌水12.75 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃/59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃延伸7 min，12 ℃终止。将PCR扩增产物直接送往北京擎科生物公司通过ABI3730测序仪进行基因分型，使用GeneMapper v3.2 软件分析各样本等位基因数及其等位基因片段的长度。

1.3 遗传多态性和群体遗传分化分析

每个微卫星位点的等位基因数(N)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)通过Cervus 2.0 软件计算获得[8]。使用Structure Version 2.2软件[9]基于混合模型对牦牛群体的遗传结构进行预测。预设群体分化数目(K值)为2～5，将马尔可夫链(Markov chain)开始时的迭代次数设为110 000次，删除前10 000 次不作统计，每个K值重复运行5 次。若似然值随着预设K值的增大而增大，则按Evanno等[10]提出的用ΔK来确定合适的K值，并推断牦牛群体中的亚群数，构建群体遗传结构图。

2 结果与分析

2.1 不同微卫星位点的基因分型

4个微卫星位点在130头麦洼牦牛个体的基因分型结果如表2所示。由表2可知，Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215位点分别有7，5，8和8个等位基因，4个微卫星位点的平均等位基因数为7；Bogr204位点的等位基因片段相对较小，为153～164 bp，而其余3个位点等位基因片段长度在226～261 bp。

表2 麦洼牦牛群体在4个微卫星位点的多态性

2.2 麦洼牦牛群体的遗传多态性

由表2可知，麦洼牦牛群体在4个微卫星位点的平均观察杂合度(Ho) 为0.626，其值为0.521～0.780；平均期望杂合度(He)为 0.800，其值为 0.761～0.852；平均多态信息含量(PIC)为0.751，其值为0.712～0.801。可见麦洼牦牛群体在4个微卫星位点均具有较丰富的多态性。

2.3 麦洼牦牛群体的遗传结构

通过Structure Version 2.2软件对麦洼牦牛群体的遗传结构进行分析，并根据Evanno等[10]提出的方法推断麦洼牦牛的亚群数，结果(图1)表明，当群体分化数目K=2时，群体遗传结构图中出现稳定的亚群；而当K=3、K=4或K=5时，群体遗传结构图中亚群的分化呈现出不稳定和较混乱的状态。可见，麦洼牦牛群体存在较明显的群体遗传分化特征，作为著名牦牛品种的麦洼牦牛可能分化为至少2个亚群。

图1 130头麦洼牦牛个体在4个微卫星位点的Structure群体结构

3 讨 论

麦洼牦牛是生活在我国四川西北高寒草地的优良地方牦牛品种，主要分布在阿坝州的红原、若尔盖、阿坝、松潘、壤塘及甘肃甘南州的玛曲等地，现存栏90余万头。由于分布区域广、数量多，因此麦洼牦牛品种的群体遗传结构可能复杂而多样。但是，目前关于牦牛群体遗传的研究全部限于不同牦牛品种(类群)之间系统进化关系的分析探讨，且选用的遗传标记为mtDNA序列，而关于各个牦牛品种(类群)内部遗传分化特征的研究尚未开展[11-13]。

微卫星DNA分子标记具有分布广且均匀、多态信息含量高、共显性遗传、选择中性等特点，已被广泛应用于群体遗传研究。本课题组通过Dynal磁珠富集从牦牛基因组中分离出大量微卫星标记[5]，从中筛选出多态性较好的4个新的微卫星位点，对麦洼牦牛群体遗传多态性进行了分析。结果表明，麦洼牦牛品种在4个新微卫星位点共有28个等位基因，而Qi等[14]运用3个普通牛微卫星标记在麦洼牦牛中只检测到8个等位基因，因此在PCR扩增中，相对普通牛微卫星引物，牦牛自身基因组的微卫星引物与牦牛基因组模板具有更高的结合力。虽然麦洼牦牛群体在4个新微卫星位点具有较高的遗传多态性，平均观察杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)分别达到0.626，0.800和0.751，但是由于微卫星位点数量少而提供的遗传多态性信息量仍较为有限，后续研究还需要分离鉴定更多的高度多态性微卫星位点用于分析麦洼牦牛群体的分化特征。

通过Structure软件能够较明确地将麦洼牦牛群体区分为2个亚群，这与麦洼牦牛分布地域广泛有较大关系。本研究选取的部分牦牛个体来自红原县麦洼牦牛原种场，部分来自屠宰场，而屠宰场的牦牛可能来自红原周边的若尔盖、阿坝、松潘和壤塘等县。但是本研究划分的2个亚群中究竟包含了哪些个体，分别来自哪些区域，由于获得的样品缺乏准确记录而无法确定。所以，对于不同地域的麦洼牦牛群体的遗传特征尚需要进一步研究。

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