刘铁兵 龚金炎，2 朱银邦 李博斌，2 赵 振 郭小青 黄 俊

（浙江科技学院生物与化学工程学院1，杭州 310023）

（绍兴市质量技术监督检测院博士后工作站2，绍兴 312071）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），广泛存在于自然界，由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化而来，是哺乳动物、甲壳类动物和昆虫中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质［1］，具有镇定神经，抗焦虑、解毒等功效［2-5］。

关于γ-氨基丁酸的检测近年来国内外已有氨基酸分析仪测定、色质联用法、柱层析荧光测定法、高效液相色谱法等报道［6-12］，柱前衍生化法鲜见报道。

本试验采用丹磺酰氯作为衍生剂，建立了一种快速测定以糙米、活性红豆、活性绿豆、活性谷胚芽等的农产品中γ-氨基丁酸含量的柱前衍生化高效液相色谱方法。成功的分析了其中γ-氨基丁酸的含量，在精密度、稳定性、灵敏度等方面取得了较好的结果。

1 材料与方法

1.1 设备与试剂

LC-20A液相色谱仪（Prominence SPD-20A／20AV UV-VIS检测器）：日本岛津公司；色谱柱：Hypersil ODS2 C18（5μm ×4.6 mm×250 mm）：大连依利特；溶剂抽滤装置：天津市琛航科技仪器有限公司：PHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；甲醇（色谱纯）、γ-氨基丁酸（纯度＞99%）、丹磺酰氯（纯度＞99%）：天津四友精细化学品有限公司；活性谷胚芽粉、活性红豆、糙米、活性绿豆等：宁波天禾堂生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 pH值和衍生化时间的确定

0.1mol／L的醋酸钠溶液调pH分别为6.0、7.0，0.1 mol／L的碳酸氢钠溶液调 pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，将上述7种溶液分别配成含1.0 mmol／L的γ-氨基丁酸溶液，然后各取0.2 mL，再加入等量的丹磺酰氯丙酮（4.0 g／L）溶液，避光，置于55℃水浴中衍生1 h。结果表明，当pH≥7.5时，样品中的γ-氨基丁酸与丹磺酰氯全部结合，色谱峰面积稳定。由于样品水提取物存在的酸度不同，当提取物被0.1 mol／L碳酸氢钠溶液稀释时，稀释后的样品pH只要大于7.5，则该方法具有良好的重现性。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠8.4 g溶于900 mL水中，用1 mol／L氢氧化钠溶液调节 pH至9.5，加水至1 L，配成0.1 mol／L溶液。

1.2.2.2 衍生试剂丹磺酰氯溶液：称取丹磺酰氯0.04 g，加丙酮稀释至10 mL，摇匀，配成4 g／L的溶液，置于4℃冰箱中密封避光保存。

1.2.2.3 标准样品溶液：称取γ-氨基丁酸标样0.01 g，用上述碳酸氢钠溶液定容至10 mL，配成1 mg／mL的母液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 标准溶液

取各浓度标准溶液和丹磺酰氯溶液各0.2 mL置于1 mL棕色容量瓶中，摇匀，于55℃水浴中避光进行衍生化，1 h取出，冷却至常温后，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜。

1.2.4 色谱条件

泵：四元梯度泵；色谱柱：ODSHYPER-SIL C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm）；流速：1.0 mL／min；柱温：30℃；流动相：A，甲醇（50%）；B，水（50%）；进样量：5μL。

1.2.4.1 波长的选择：对γ-氨基丁酸与丹磺酰氯衍生物在190～400 nm进行全波长扫描，γ-氨基丁酸在254 nm波长处有主要吸收峰，故选取254 nm为检测波长。

1.2.4.2 梯度洗脱程序：用1.0 g／L标准溶液衍生物按图1梯度洗脱程序进行探索，找出最佳流动相比例。

图1 梯度洗脱程序图

根据梯度洗脱程序进行试验得出的结果表明，γ-氨基丁酸衍生物在流动相配比为A∶B＝50∶50时出峰效果较好，故梯度洗脱程序为图2；色谱图见图3。

图2 梯度洗脱程序图

图3 1 mg／mLγ-氨基丁酸标准液衍生物色谱图

1.2.5 线性关系：取1 mg／mL的标准溶液母液分别稀释成0.50、0.25、0.20、0.10、0.05 mg／mL的标准溶液，制成6个浓度梯度考察线性关系，各浓度标样衍生后用0.45μm微孔滤膜过滤。每个浓度的标样分别做3次平行试验，得到的峰面积取平均值，获得峰面积（X）对质量浓度（Y，mg／mL）的线性回归曲线。

1.2.6 精密度：用上述检测方法平行测定同一标准溶液（0.40 mg／mL）衍生物样品6次。

1.2.7 重复性：用上述建立的检测方法平行测定活性红豆样品6次。

1.2.8 稳定性：取同一标准溶液衍生物样品（1.00 mg／mL），放置于4℃的冰箱中避光保存，分别保存0、1、3、7 d，每个时间点平均测定3次。

1.2.9 回收率：取0.50 mL 1.00 mg／mL标准溶液分别加入到0.50 mL活性红豆、活性绿豆、糙米、活性谷胚芽样品中，采用相同处理方法和HPLC条件进行3次平行测定。

1.2.10 检测限：选取3个标准溶液质量浓度0.05、0.10、0.20 mg／mL，每一个浓度水平上分别重复测定，将检测的结果进行线性回归。

1.2.11 样品预处理方法

分别取糙米、活性红豆、活性绿豆、活性谷胚芽样品，经分别粉碎后，准确称取各样品10.0 g，用碳酸氢钠溶液定容至100 m L，浸提1 h，取10 mL于5 000 r／min离心40 min，取上清液和丹磺酰氯溶液各0.2 mL置于1 mL棕色容量瓶中，摇匀，于55℃水浴中避光进行衍生化，1 h取出，冷却至常温后，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜。

2 结果与分析

2.1 保留时间

根据以上色谱条件，用1.00 mg／mL的标准溶液衍生物和空白样进行对比实验，结果表明，γ-氨基丁酸衍生物的保留时间为6.454 min，色谱图见图3、图4。

图4 空白样色谱图

2.2 线性关系

浓度和峰面积的线性关系为Y＝1.7E-7X-0.001 97，R2＝0.999 9（标准曲线图见图5），由于衍生过程中标样被稀释5倍，故该线性方程表明γ-氨基丁酸浓度在0.01～0.2 mg／mL时具有良好的线性关系。

图5 标准曲线图

2.3 精密度

试验得到的峰面积值依次为2 500 874、2 503 758、2 511 250、2 507 524、2 505 683、2 502 675平均值为2 505 294，相对标准偏差RSD为0.15%。

2.4 重复性

样品中γ氨基丁酸的含量依次为270.2、263.6、269.8、268.7、270.5、264.0μg／g，平均值为 267.8 μg／g，相对标准偏差为1.12%。

2.5 稳定性

测得的γ-氨基丁酸衍生物峰面积平均值依次为 5 983 529、5 982 715、5 980 866、5 979 673，相对标准偏差为0.03%，表明样品在4℃避光保存一周内是比较稳定的。

2.6 加标回收

由表1可知平均回收率99.67%，平均相对标准偏差1.17%，符合定量分析的要求。

试验得出每个浓度水平的标准偏差S1＝0．000 505 106、S2＝0．000 244 92、S3＝0．002 513 26。用线性回归法作出回归线y＝0．014 7x-0．000 6，然后把回归线延长，外推至与纵坐标相交，求得S0＝0．000 6，定义3 S0为方法的检测下限，即为0.001 8 mg／mL。

表1 活性红豆、活性绿豆、糙米、谷胚芽加标回收率／%

2.7 农产品中GABA含量测定

按照上述的检测方法，测得的活性红豆样品的HPLC图谱见图6；测得的活性绿豆样品的HPLC图谱见图7；测得的糙米样品的HPLC图谱见图8；测得的活性谷胚芽样品的HPLC图谱见图9。由图可见保留时间6.0～6.4 min之间有1明显的峰，即为γ-氨基丁酸衍生物的峰。

图6 活性红豆样品HPLC图谱

图7 活性绿豆样品HPLC图谱

根据上述方法，对活性红豆、活性绿豆、糙米和谷胚芽粉进行处理衍生后过0.45μm微孔滤膜。按照上文建立的检测方法平行测定3次，所得的农产品中含的γ-氨基丁酸含量见表4。该方法回收率在95%以上，4种产品相对标准偏差分别为0.86%、1.35%、1.41%、1.06%，测定结果可靠。

图8 糙米样品HPLC图谱

图9 谷胚芽样品HPLC图谱

表2 农产品样品中γ-氨基丁酸含量

由表2可见，活性红豆、活性绿豆、糙米和谷胚芽中γ-氨基丁酸的含量都在200～300μg／g之间，其中活性红豆最高，适合用于富集GABA。

3 结论

研究建立了丹磺酰氯柱前衍生化法测定农产品中γ-氨基丁酸含量的高效液相色谱方法。经过优化后的色谱条件为：Hypersil ODS2 C18，流动相A为甲醇，B为水（A∶B＝1∶1，pH＝9.5，梯度洗脱），检测波长为254 nm，柱温为30℃，流速为1mL／min，进样量为5μL。该方法高效快速，操作简便，检测限低，稳定性和重现性好。用标准样品考察其线性关系，所得线性方程为 Y＝1.7E-7X-0.001 97，R2＝0.999 9，表明γ-氨基丁酸质量浓度在0.01～0.2 mg／mL时具有良好的线性关系。精密度试验、重复性试验和稳定性试验的相对标准偏差分别为0.15%、1.12%、0.03%，表明该方法的精密度、重复性和稳定性都较好。加标回收试验所测得的平均回收率为99.67%，表明用该方法所测得的结果可信度较高，可作为GABA含量的定量分析方法。实际样品检测效果良好。

［1］叶惟泠.γ-氨基丁酸的发现史［J］.生理科学进展，1986，17（2）：187-189

［2］杨藻宸.药理学和药物治疗学（上册）［M］.北京：人民卫生出版社，2000：487-530

［3］木尾本修身，平田洋，中川聪史，等.GABA含有につ酵乳制品の正常高值血压者にちまょゐ降压效果［J］.日本食品科学工学会志，2004，51（12）：79-86

［4］茅原，杉浦友美.近年のGABA生理机能研究-脑机能改善作用、高血压作用を中心に［J］.食品开发，2001，36（6）：426

［5］徐叔云.临床药物指南 ［M］（修订版）.合肥：安徽科学出版社，1997

［6］陈海军，林亲录，王婧，等.γ-氨基丁酸测定方法的研究［J］.食品工业科技，2007，28（5）：235-238

［7］黄亚辉，曾贞，郑红发，等.GABA茶中γ-氨基丁酸的TLC测定及提纯研究［J］.氨基酸和生物资源，2008，30（3）：11-15

［8］何秋云，杨志伟.马铃薯中γ-氨基丁酸快速测定方法的研究［J］.食品安全与检测，2010，35（10）：262-266

［9］Xiaoyuan Mao，Yonggang Cao，Dongyu Min，et al.RP-LC with Fluorescence Detection of Amino Acids in Rat Brain Synaptosomes［J］.Chromatographia，2011，73：157-163

［10］Khuhawar M Y，Rajper A D，.Liquid chromatographic determination ofγ-amino-butyric acid in cerebrospinal fluid using 2-hydroxynaphthadehyde as derivatizing reagent［J］.Journal of Chromatography B，2003，788：413-418

［11］冯德明，张洋，赵惠明，等.反相高效液相色谱法测定黄酒中的有机酸［J］.分析与检测，2009，3（5）：157-161

［12］Silva DM F，Ferraz V P，Ribeiro A M.Improved high performance liquid Chromatographicmethod for GABA and glutamate determination in regions of the rodent brain［J］.Journal of Neuroscience Methods，2009，177：289-293.