王若兰 张丽丽 曹志帅 王 晨

（河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001）

近年来，粮食安全问题愈益受到重视。保障粮食安全，既要靠增加产量也要靠延缓粮食种子衰老，提高产后储备质量。目前关于种子衰老机制的研究尚未形成体系，存在多种假说，其中自由基伤害学说受到广泛重视［1］。自由基是有氧代谢不可避免的产物［2］。Harman［3］和 Fridovich［4］提出的自由基理论，指出衰老过程是细胞和组织中不断进行着的自由基损伤反应的总和。多项研究表明，种子衰老与细胞超微结构损伤密切相关［5-6］。

国内外针对粮食种子特别是小麦种子的储藏衰老研究侧重于生理生化方面，较少结合细胞超微结构的变化，在细胞水平上探究储藏衰老机制。研究表明，小麦的胚乳细胞在小麦籽粒成熟后已被淀粉和贮藏蛋白充实而死亡，其主要生理功能是为胚活动提供营养，而小麦的胚细胞是小麦生理活性的集中体现［7］，胚细胞的衰老导致小麦生理活性的降低，进而影响小麦衰老进程。本试验基于衰老的自由基理论，通过研究不同储藏微环境下小麦衰老和胚细胞超微结构的变化规律，探讨小麦衰老与胚细胞超微结构损伤之间的关系，以期进一步丰富储藏小麦的衰老机制研究，为延缓小麦衰老和安全储藏提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦“瑞星1号”，2012年收获，河南瑞星种业公司提供，容重801 g／L，含水量11.4%，粗蛋白和湿面筋质量分数分别为13.82%和30.00%。

1.2 主要仪器

JEM-1400透射电子显微镜：日本电子公司；752N紫外分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；GL-20G-II高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；JXFM110锤式旋风磨：上海嘉定粮油仪器有限公司；HWS恒温恒湿培养箱：宁波东南仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 储藏条件

根据我国粮食储藏生态区域的划分标准，模拟小麦主要储藏区（主要为粮食储藏生态区的蒙新区、华北区、华中区、华南区）的气候条件，设置对应的温湿度分别为 A：（15℃，50%）、B：（20℃，65%）、C：（28℃，75%）、D：（35℃，85%）4个条件，利用恒温恒湿箱进行人工模拟储藏（分别以A、B、C、D代表对应的储藏条件），每30 d为1个储藏期，储藏150 d。

1.3.2 细胞超微结构观察

根据参考文献［8］的方法，并作修改。在室温下，取小麦籽粒的胚放入4%的戊二醛溶液中4 h进行前固定，之后用PH为7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗4次，每次15 min，再将其投入1%锇酸溶液中90 min进行后固定，并用 PBS漂洗3次，每次15 min；将样品依次放入丙酮浓度梯度分别为30%、50%、70%、90%、100%的溶液中进行逐级脱水，每次15 min；然后再依次置入环氧树脂812与丙酮比例分别为1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的混合液中进行浸透处理，每次120 min。将浸透好的样品依次放入37、45、60℃的鼓风干燥箱中各加热12 h，最后用LKB-Nova超薄切片机进行切片，厚度为80 nm。再经醋酸铀染色25 min和柠檬铅染色20 min后，在透射电镜下观察并拍照。

1.3.3 超氧阴离子自由基含量（O2-·）的测定

按照参考文献［9］植物超氧阴离子自由基含量的测定方法并略加修改：植物样品量改为2.5 g，离心的转速改为12 000／min，其他方法不变。

1.3.4 丙二醛含量的测定

参照参考文献中的方法［10］，并修改如下：将小麦磨成粉，分别称取小麦粉试样（2.0±0.1）g并加入7 mL 10%的三氯乙酸（TCA）溶液，中速震荡10 min后置于离心管中，以4 800 r／min的转速离心10 min将上清液定容至10 mL，得到的即为丙二醛提取液。

1.3.5 种子活力的测定

采用 TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法，按照文献［9］的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 小麦胚细胞中超氧阴离子自由基（O2·-）含量的变化

McDonald［11］和 Tian等［12］研究认为，种子衰老与自由基代谢失调累积密不可分。由图1可知，随储藏时间延长，小麦胚细胞中的O2-·含量整体呈现上升趋势。O2-·可引起细胞的氧化胁迫，而其含量的不断积累会加剧细胞氧化损伤［11-12］。T检验结果表明，储藏90 d后O2-·含量已显著高于前期（P＝0.02＜0.05），可能是储藏后期胚细胞内各项调控能力不断减弱，线粒体结构和功能受损，呼吸链的电子泄漏严重，使自由基得以快速积累［12］。

图1 小麦细胞中O2·-含量的变化

不同的温湿度条件对O2-·产生速率的影响各不相同。从图1可明显看出，在微环境A和B条件下，O2-·含量变化平缓，增幅小，分别只有19%、30%。而微环境C和D条件下的O2-·含量增幅较明显，分别达到75%、124%，尤其在D条件下，O2·-含量水平显著高于A条件（P＝0.011＜0.05）。这表明储藏微环境的温湿度是影响O2·-产生速率的重要因素。在正常情况下，细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡，自由基浓度低，不会引起伤害，而在高温高湿逆境条件下，这种平衡更易遭到破坏，自由基代谢失调，使得细胞内基态分子氧单电子还原的效率增高，产生的O2·-速率增大［12］，细胞衰老加快。

2.2 小麦胚细胞中丙二醛含量的变化

Sung［13］和 Bailly［14］提出自由基积累导致膜的氧化是种子衰老的主要原因。丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化作用的最重要产物之一，它的生成和积累会引起蛋白质、核酸等生物大分子的交联聚合，进而对细胞产生毒害作用。

图2 小麦细胞MDA含量的变化

由图2可看出，与O2-·相似，小麦胚细胞的MDA含量随储藏时间延长也呈现不断上升的趋势，并且经T检验，储藏90 d后，MDA含量的变化幅度同样明显大于前期（P＝0.011＜0.05）。不同的温湿度条件下，小麦胚细胞MDA含量的变化差异也较大。在A、B、C、D条件下，MDA含量由1.23分别增加到1.39、1.41、1.73、2.02（10-3umol／g），增加幅度分别达到8%、8.2%、148%、172%。由此可见，C和D条件下的小麦总是比A和B条件下的小麦胚细胞MDA含量增加得更明显。尤其在D条件下，MDA含量显著高于A条件（P＝0.045＜0.05），说明高温高湿环境易促进细胞膜脂过氧化，从而导致有毒产物快速积累，且随储藏时间延长，膜脂过氧化作用不断加剧。

分析可知，小麦胚细胞中O2-·和MDA含量的变化存在一定的关联性，首先细胞中积累的自由基氧化攻击膜脂中的不饱和双链酸，诱发细胞膜脂过氧化，进而导致脂类本身被破坏，再经过一系列复杂反应产生MDA等有毒产物，对细胞产生毒害作用，致使细胞衰老甚至死亡。

2.3 小麦种子活力的变化

种子活力是种子品质的一个重要指标。种子在储藏过程中受储藏条件的不利影响，胚细胞的结构和生理功能受到损害而逐渐衰老，导致种子活力下降，种子衰老甚至劣变［15］。由图3可看出，随储藏时间的延长，小麦种子活力整体呈下降趋势，高温高湿（C和D）条件下，活力下降最明显，尤其D条件下的种子活力由96%降至21%，降幅显著高于A和B条件（P＜0.05）。这表明，高温高湿条件对小麦种子活力的影响显著，小麦衰老速度较快。因此储藏微环境的温湿度是影响小麦安全储藏的主要调控因素。

图3 小麦种子活力的变化

2.4 小麦细胞超微结构的变化

从图4可观察到，原始小麦胚细胞形态及各细胞器正常，显示出良好的结构和功能。细胞壁结构致密，可清楚看到纤维素微纤丝，细胞膜平整光滑（图4d）；细胞基质致密均匀；细胞核占据细胞的较大空间，核膜、核仁清晰可辨，核质均匀，着色较淡，常染色质较异染色质丰富（图4a），说明核内DNA双螺旋结构大部分处于松弛状态，核酸在此期经历着活跃的转录和合成代谢；线粒体数量丰富，呈比较规则的圆形或卵圆形，双层被膜结构完整，内膜的脊密集清晰（图4a，图4b），说明细胞正在进行着旺盛的能量代谢；细胞内蛋白体充盈，呈现规则的球形，大小不等；脂肪体丰富，并均匀分布在细胞膜和蛋白体附近（图4d）。在胞间质中还可观察到大量的胞间连丝和成列的小囊泡（图4b，图4c），可以认为小囊泡此时正在执行它的胞间物质运输和信号传递功能，张伟成等［16］称此现象为跨膜囊泡转移。由图4d可清晰地看到在细胞壁上附着有丰富的Ca2+，Ca2+可与细胞壁的果胶质结合，丰富的Ca2+有助于延缓胚细胞衰老，提高种子活力，进而提高储藏品质。

图4 原始小麦细胞的超微结构

对比图5～图7可看出，在不同的温湿度条件下，经过150 d的储藏，小麦的胚细胞超微结构都发生了不同程度的变化。在A条件下的小麦胚细胞超微结构与原始小麦相比无明显变化，细胞及内部各细胞器均保持较良好的结构，多数细胞的核染色质出现轻度的凝聚，说明低温下核酸代谢并不旺盛，小麦胚细胞多处于相对静止的状态（图5a，图5b）。在B条件下的小麦胚细胞与原始小麦相比出现了一定的变化，主要表现为：细胞核染色质凝聚稍有加重；线粒体内膜脊的数量有所减少，脊的双层膜结构出现模糊。线粒体是细胞能量代谢的主体，也是自由基产生的主要部位［11］，其结构的损伤将直接影响细胞的能量代谢和自由基水平（图5c、图5d）。

图5 A、B条件下储藏150 d后的小麦胚细胞超微结构

在C条件下的小麦胚细胞与原始小麦相比发生了较明显的变化。首先，细胞壁开始出现轻度溶解，少部分细胞膜轻度内陷，膜的完整性遭到破坏，并且几乎找不到Ca2+的存在。其次，细胞核质不均匀，异染色质凝聚加重，多成片状（图6a），说明此时细胞的核酸代谢减弱了。完整线粒体数目减少，线粒体变化出现2种情况，一种是线粒体外膜破损，内膜的脊出现不同程度的解体而变得模糊，内腔出现空泡化。另一种是线粒体外膜完整，但出现内陷变形，没有空泡化（图6b、图6c），说明此时细胞的能量代谢也在降低，而自由基正在快速积累。此外蛋白体和脂肪体也出现了不同程度的降解，数量减少，这可能与细胞的耗能代谢有关，蛋白体和脂肪体分解可为细胞供能（图6c）。

图6 C条件下储藏150 d后的小麦胚细胞超微结构

在D条件下的小麦胚细胞与原始小麦相比，变化最为显著。大部分细胞形态已出现变形，细胞壁纤维丝模糊不清，部分膜内陷破裂，膜的完整性几近丧失，已经看不到Ca2+；细胞核质着色加深，异染色质充满整个细胞核，核仁分裂为多个小核仁，少部分细胞的核仁已溶解不见；线粒体数量明显减少，大部分线粒体内部降解严重，脊的双层膜已无法辨认，有的线粒体甚至已完全空泡化。蛋白体也严重降解，有的已濒临解体，围绕其周边的脂肪体数量也明显减少（图7）。在细胞间质中几乎看不到胞间连丝以及成列的小囊泡。说明此时胚细胞中的核酸代谢，能量代谢，物质代谢以及信息传递等已不能正常进行，胚细胞衰老严重。

图7 D条件下储藏150 d后的小麦胚细胞超微结构

以上分析均显示出，随着储藏时间的延长，小麦胚细胞的超微结构在不断发生劣变。并随储藏温湿度的增大，劣变越趋严重，胚细胞衰老加快。这一变化与胚细胞中O2-·和MDA含量以及种子活力的变化规律保持高度一致，表明小麦胚细胞的损伤劣变和衰老与O2-·、MDA的产生和积累存在着一定的相关性，胚细胞的衰老导致小麦种子活力下降，进而加快小麦衰老进程。

多项研究认为，O2-·积累引起细胞氧化损伤是种子衰老的关键［4，10-11］。这一理论也较符合小麦的衰老进程。低温低湿环境下，O2-·和MDA含量保持在较低的水平，胚细胞超微结构较良好，细胞内的各项代谢基本处于平衡状态。小麦在受到高温高湿的逆境胁迫时，胚细胞内的O2-·代谢失调，不断积累的O2-·加大了对胚细胞内脂质、蛋白质等大分子的损害，使细胞内的有毒产物不断积累，细胞超微结构上的氧化损伤也随之发生，破坏了细胞进行正常生命活动的结构基础，降低了细胞的活力，同时也减弱了细胞内抗氧化系统对O2-·的清除水平，而这又会进一步加快O2-·的产生，致使其产生和清除的平衡不断被打破，形成一个恶性循环，加速了胚细胞的衰老进程，种子活力快速下降，从而加重了小麦的衰老。因此在小麦储藏过程中，采用低温低湿环境，易于减缓小麦的衰老，保持小麦的品质。

3 结论

随储藏时间的延长和温湿度的增高，小麦胚细胞中的O2·-和MDA含量不断增加。与此同时胚细胞的超微结构都发生了不同程度的损伤劣变，且温湿度越高，劣变越严重，种子活力下降越明显，种子衰老越快。低温低湿（A和B）的条件下，胚细胞中的O2·-和MDA含量均保持在较低的水平，胚细胞超微结构的变化均不明显，种子活力较高；高温高湿C和D条件下，O2·-和MDA含量快速增加，细胞超微结构发生了较明显的劣变。在C条件下，部分细胞膜的完整性遭到破坏，染色质凝聚加重，线粒体数目减少，内外膜出现损伤，而小麦种子活力也出现了较明显的下降；在D条件下，细胞超微结构劣变更加严重：大部分细胞形态已变形，细胞膜完整性几近丧失；异染色质充满整个细胞核，核仁分裂甚至溶解；线粒体明显减少，内部降解严重甚至已完全空泡化；贮藏物质解体，几乎找不到执行胞间物质运输及信号传递的小囊泡。此时小麦胚细胞的O2·-和MDA含量增加最明显，增幅分别达到124%、172%，而种子活力下降也最明显，降幅达到75%，三者变化幅度都显著高于低温低湿（A和B）条件（P＜0.05）。

小麦储藏过程中自由基的产生、有毒物质的积累和细胞超微结构损伤三者之间相互关联，促使细胞衰老，降低种子活力，进而影响种子衰老进程。储藏微环境中的温湿度是影响小麦细胞衰老进程的重要因素，高温高湿环境易加速细胞衰老，而低温低湿环境利于延缓衰老，保藏小麦品质。

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