李 永 陈有亮 任大喜

（浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

蛋黄油脂是从蛋黄中提取的脂质，因提取方法不同成分有较大差异，但含有丰富的卵磷脂、不饱和脂肪酸是其主要特征。具有调节血脂，改善神经功能等多种生理功能，广泛应用于食品、医药领域［1］。但因蛋黄胆固醇含量过高，制取的蛋黄油脂同样胆固醇含量很高。而摄入高胆固醇食品会造成血清胆固醇升高，引发心血管疾病［2］，低胆固醇食品的膳食成为人们的首选。因此，设法脱除食品中的胆固醇成了研究的热点。

β-环糊精（β-cyclodextrin，简称 β-CD）是由7个吡喃葡萄糖单元以α-（1，4）-糖苷键连接而成的环状低聚物，作为食品添加剂广泛应用于食品工业［3］，可脱除胆固醇，防止微生物污染和褐变反应［4］，保持香味，消除不良气味［5］。

目前国内外对生产低胆固醇食品研究主要集中在用胆固醇氧化酶降解，乳酸菌发酵，β-CD包合以及纳滤、萃取、溶剂抽提等物理化学方法脱除胆固醇［6-7］。然而，与其他脱除胆固醇工艺相比，β-CD包合法具有脱除效率高、工艺简单可行的优点［8］。

通过β-CD包合法脱除动物性产品中的胆固醇已有大量研究［9-15］。在美国利用β-CD制造的低胆固醇蛋品早已进入市场［16］。在国内β-CD包合法制造低胆固醇蛋黄的研究大部分集中在直接从蛋黄液中脱除胆固醇，结果会造成蛋黄中蛋白质、磷脂等营养物质的部分损失［17］，但是β-CD包合法脱除蛋黄油胆固醇的研究国内外鲜有报道。本试验利用响应面设计优化了β-CD脱除鸭蛋黄油脂胆固醇。通过优化工艺参数，提高胆固醇脱除率和油脂回收率，为工业化生产低胆固醇蛋黄油脂提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-CD：孟州市华兴生物化工有限责任公司。

TG16-WS台式高速离心机：湘仪离心机仪器有限公司；721N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；JHS-1电子恒速搅拌机：杭州仪表电机有限公司；SY-6000小型喷雾干燥仪：上海世远生物设备有限公司；R系列旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司。

鸭蛋黄油脂：新鲜鸭蛋黄与水按1∶1.5（体积比）混合，2层纱布过滤除去系带、蛋黄膜后，以进口温度165℃，出口温度82℃，进行喷雾干燥制得蛋黄粉。然后将一定质量的蛋黄粉与乙酸乙酯按1∶12（m∶V）混匀，35℃回流提取60 min。提取完毕，真空抽滤、取滤液进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到鸭蛋黄油脂（主要成分为三酰甘油和胆固醇，其中胆固醇含量为 51.47 mg／g，三酰甘油含量为 948.53 mg／g）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

采用响应曲面设计，进行试验条件的优化。选用五因素五水平中心组合设计确定5个处理因素对胆固醇脱除率（Y1）和蛋黄油脂回收率（Y2）的影响。基于前期初步试验研究，选取水油比（W∶O）、β-CD与油之比（β-CD∶O）、时间、温度、搅拌速度5个因素。试验因素水平及编码见表1，响应曲面设计及结果见表2。

表1 因素水平编码表

表2 响应曲面设计及结果

表2 （续）

1.2.2 试验步骤

取一定质量鸭蛋黄油脂，将不同质量浓度的β-CD溶液与蛋黄油脂混匀。在不同的水浴温度和时间下，用恒速搅拌机以不同的搅拌速度搅拌。然后6 000 r／min，5 min离心处理，上清液即为低胆固醇蛋黄油脂。取上清液测定胆固醇含量，计算胆固醇脱除率见式（1）；同时称量上清液质量，计算蛋黄油脂回收率见式（2）；回收中间层胆固醇-β-CD复合物。

式中：W1为原蛋黄油脂胆固醇含量／mg／g；W2为上清液胆固醇含量／mg／g。

式中：m1为上清液油脂质量／g；m2为原油脂质量／g。

1.2.3 胆固醇含量测定

采用直接皂化法测胆固醇含量［18］，并做适当改进。

1.3 数据分析

应用Design-Expert.V8.0.6软件中的Central Composite Design进行试验设计，建立回归模型及方差分析。

2 结果与分析

2.1 胆固醇脱除率（Y1）响应面分析

2.1.1 回归模型建立及显著性检验

对表2结果进行回归分析，拟合的胆固醇脱除率（Y1）对 W∶O（X1），β-CD∶O（X2），时间（X3），温度（X4），搅拌速度（X5）的二次回归方程为：

从表3知，失拟检验不显著（F1＝2.56，P＝0.102 7），模型合适，说明该方程与实际情况拟合良好。方差分析结果表明二次回归方程极显著（P＜0.000 1），同时也说明不必拟合更高次幂的方程。

为了分析各因子对回归方程的影响，对偏回归系数进行分析（表3），X2、X4对蛋黄油脂胆固醇脱除率有极显著影响（P＜0．01），而 X1、X3、X5无显著影响（P＞0．05），但是 X1X3、X3X5的交互效应对胆固醇脱除率有显著影响（P＜0．01）。X12、X5

2也是显著项（P＜0．01），同时需要指出的是 X52的二次项的F值比其他项都大，表明搅拌速度的二次回归效应作用最大。

表3 二次回归方程、偏回归系数显著性检验的方差分析

2.1.2 单因子及交互效应分析

由表3可知，5个因素对胆固醇脱除率（Y1）的影响顺序为：温度 ＞β-CD∶O＞时间 ＞搅拌速度 ＞W∶O。图1a反应了当某个因子变动，而其他因子保持不变时对胆固醇脱除率的影响［19］。W∶O（A）、时间（C）、搅拌速度（E）的编码值增大时胆固醇脱除率先增大后降低。β-CD∶O（B）在-1～+1的整个编码区内变化时，胆固醇脱除率一直在增大。温度（D）在编码区-1～+1内升高时，胆固醇脱除率呈线性降低；在所有因素中，温度对二次回归方程的直线效应最显著。

图2a可知，在W∶O的整个编码区内，随搅拌时间的延长，胆固醇脱除率先增大后减小；而搅拌时间固定某一值后，胆固醇脱除率也随W∶O增大先增大后减小，说明加水必须适量，太多的水反而会使油脂中胆固醇稀释，不利于胆固醇与β-CD的接触形成包合物。只有W∶O和搅拌时间同时增大到一定程度时胆固醇脱除率才能达到最大，二者的交互效应表现为胆固醇脱除率的增大。

图2b可知，当时间保持不变，随搅拌速度增大，胆固醇脱除率先增大后减小；在较低转速时，延长搅拌时间，胆固醇脱除率升高，当搅拌速度较快时，胆固醇脱除率随时间延长先增大后减小。这表明只有适中的搅拌速度和时间才能获得较大的胆固醇脱除率，搅拌速度过高过低都不利于脱除胆固醇。同时需要指出的是X3X5的系数交互项是负值（-0.90），只考虑此交互效应的话，负值表明随响应值Y1增加，搅拌速度X5和时间X3的编码值需有不同的符号，即，一个必须大于零，另一个必须小于零［20］。即，当 Y1达到最佳值时，（X3，X5）＝（0.987，-0.639）。

图1 单因子效应图

图2 胆固醇脱除率响应曲面图

2.2 蛋黄油脂回收率（Y2）响应面分析

2.2.1 建立回归模型及显著性检验

对蛋黄油脂回收率（Y2）先建立一个二次回归模型。由表4可知，二次回归方程模型显著（F2＝2.65，P＝0.008 3＜0.05），但是失拟检验也显著（F1＝8.43，P＝0.003 8＜0.05），说明二次回归模型虽然有意义但其在整个回归空间内的拟合度并不是很好，需要拟合更高次的回归模型，即建立非标准模型。因每个因素都有5个水平，因此模型中可以包含四次项，选用逐步筛选法（αin＝αout＝0.10）对变量进行筛选，通过计算机生成设计来找出一个更好的模型［19］。

表4 二次回归方程显著性检验的方差分析

表5是新建的四次回归模型的方差分析，可以看出对油脂回收率（Y2）建立的四次回归模型明显要优于二次回归模型［19］，有更大的 R2（0.973 9＞0.646 4），更小的变异系数（3.71% ＜10.48%）；且失拟检验不显著（F1＝0.72，P＝0.692 9），回归模型极显著（F2＝19.85，P＜0.000 1）。

表5 通过变量筛选的四次回归模型、偏回归系数显著性检验的方差分析

2.2.2 单因子及两因子交互效应分析

由表5可知，建立的蛋黄油脂回收率（Y2）四次回归模型中 X1、X3、X4、X5、X1X2、X1X3、X1X4、X3X4、X3X5、X22、X52、X1X2X3、X1X2X4、X1X3X4、X1X3X5、X2X4X5、X12X4、X12X5、X1X22、X12X22是显著项（P＜0.05）。各因子对蛋黄油脂回收率影响顺序为：搅拌时间＞W∶O＞搅拌速度＞温度＞β-CD∶O。相对于其他两因子的交互效应，W∶O与温度、W∶O与β-CD∶O之间的交互效应对蛋黄油脂回收率的影响更大。

从图1b可知，W∶O（A）、温度（D）、时间（C）在编码区-1～+1内增大时，蛋黄油脂回收率呈线性降低。β-CD∶O（B）在编码区域内，蛋黄油脂回收率随编码值增大先增加后下降。搅拌速度（E）的编码值小于-0.862时，蛋黄油脂回收率随编码值增大而增加，随后缓慢降低，当编码值大于0.00时，蛋黄油脂回收率迅速下降。

将其他因素固定在中心点时，得到另外两因素对油脂回收率的响应曲面图（图3a～图3d）。较高的W∶O会降低油脂回收率（图3a），因为较高的W∶O会降低蛋黄油黏度，在离心分离时有助于小颗粒的沉淀，因此回收率降低。

图3 油脂回收率响应曲面图

2.3 优化组合试验条件及验证试验分析

以胆固醇脱除率为响应值，利用Design-Expert8.0.6对试验数据进行分析，当（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.865，0.904，0.966，-0.962，-0.362），即实际值为：W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，时间24.83 min，温度10.19℃，搅拌速度963.80 r／min时胆固醇脱除率理论值为73.30%。

以蛋黄油回收率为响应值时，当（X1，X2，X3，X4，X5）＝（-1.000，-0.058，-0.997，1.000，-0.750），即，在 W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，时间15.02 min，温度20.00℃，搅拌速度924.99 r／min的条件下，蛋黄油回收率理论可达77.39%。

为了获得满意的综合效果，使得胆固醇脱除率和蛋黄油脂回收率两响应值都达到最大，将二者作为共同考察指标——渴求值（Desirability），通过渴求函数（Desirability Function）的响应曲面图、等高线图优化胆固醇脱除率和油脂回收率［5］，从而确定最佳工艺参数。响应曲面可以直接反映各试验因子对响应值影响的大小，由等高线图可得到最佳条件下各试验因子的取值［21］。

将其他因子固定在最佳点处，W∶O和时间对渴求值的影响见图4b，优化的时间范围为19～23 min，W∶O范围为1.4～1.5。并且从图4a可知在时间的所有水平内，W∶O对渴求值的影响更大，W∶O超过1.45后渴求值降低。在低W∶O值时，时间变化对渴求值影响不大，W∶O值较高处，渴求值随时间延长先增大后减小。W∶O、β-CD∶O、搅拌温度固定在最佳点时，渴求值的响应曲面及等高线图见图5a～图5b。在时间的所有水平上随搅拌速度增大渴求值先增大后减小，优化的搅拌速度范围950～1 000 r／min。利用同样的方法可以分析其他因子交互效应对渴求值的影响。

渴求函数获得最大渴求值时最佳工艺参数编码值为（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.627，1.000，0.367，-1.000，-0.242），实际条件为 W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，时间21.83 min，温度10℃，搅拌速度975.83 r／min。在此条件下，预测渴求值为0.752，胆固醇脱除率 Y1＝72.65%，蛋黄油回收率 Y2＝68.33%。

对优化后最佳工艺条件A1（W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，时间21.83 min，温度10℃，搅拌速度975.83 r／min）；胆固醇脱除率最高点 A2（W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，时间24.83 min，温度10.19℃，搅拌速度963.80 r／min）；蛋黄油回收率最高点A3（W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，时间 15.02 min，温度20℃，搅拌速度924.99 r／min），3处不同的处理条件下的验证试验结果见表6。在优化的最佳工艺条件下鸭蛋黄油脂胆固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，胆固醇脱除率达70.21%，蛋黄油回收率为68.7%，与理论预测值接近。验证了模型的可靠性，同时也说明β-CD脱除蛋黄油脂胆固醇影响因素较多，工艺参数的变化会同时影响胆固醇脱除率和油脂回收率，2个指标需合理权衡。

图5 时间和搅拌速度的交互效应影响渴求值的响应曲面和等高线图

表6 验证试验

3 结论

各因子对胆固醇脱除率的影响顺序为：温度＞β-CD∶O＞时间＞搅拌速度＞W∶O；对蛋黄油脂回收率影响顺序为：时间＞W∶O＞搅拌速度＞温度＞β-CD∶O。

通过对拟合的回归方程中回归系数的显著性检验发现，一次项温度及W∶O与时间、时间与搅拌速度的交互效应对蛋黄油脂胆固醇脱除率和油脂回收率都有显著影响（P＜0.01）；W∶O与 β-CD∶O、W∶O与搅拌温度、时间与搅拌温度的交互效应虽对胆固醇脱除率影响不显著（P＞0.05），但对蛋黄油脂回收率有显著影响（P＜0.01）。

利用渴求函数的响应曲面图、等高线图优化胆固醇脱除率和蛋黄油脂回收率，确定了最佳工艺条件：W∶O＝1.45（V／m），β-CD∶O＝0.30（m／m），时间21.83 min，温度 10℃，搅拌速度 975.83 r／min。该条件下，预测渴求值为0.752，胆固醇脱除率理论达72.48%，蛋黄油脂回收率为68.05%；验证试验中鸭蛋黄油脂胆固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，胆固醇脱除率为 70.21%，油脂回收率为68.70%。

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