吴海波 齐宝坤 江连洲 李 杨

冯红霞1 曹 亮1 马文君1 丁 俭1 王 瑞1

（东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030）

（东北农业大学国家大豆工程技术研究中心2，哈尔滨 150028）

大豆不仅是优良的油料作物，也是理想的食用蛋白资源。从不同品种中提取的大豆分离蛋白的组成、结构、空间构象及热性质均不同，对大豆蛋白的营养性、功能特性有很大的影响［1］。蛋白质的功能特性大体上可以分三类：一是蛋白质与水相互作用，二是蛋白质与蛋白质的相互作用，三是蛋白质的表面性质。对于一些已知结构的蛋白质表面性质的分析表明，一些疏水基团也会出现在蛋白质表面，使蛋白质表面也具有一定的疏水性。据有关研究指出蛋白质的大分子结构，表面疏水性是影响分子间相互作用的主要因素［2］。很多研究中得出结论：蛋白质的表面疏水性是影响蛋白质功能性质的最重要的因素。

不同的大豆蛋白组分（7S或11S）具有不同的分子结构，其热性质和表面疏水性均不同，且大豆蛋白的热性质与其表面疏水性具有一定的关系。差示量热扫描法（Differential Scanning Calorimetry，简称DSC）是20世纪60年代研究出的一种蛋白质热力学分析方法，已经广泛应用于蛋白质热性质及热稳定性的研究［3］。荧光光谱法（色氨酸荧光光谱）是在三级结构层面上来解析蛋白质的构象差异，同时分析其空间微环境的变化。

本试验分别采用DSC法和荧光光谱法对不同品种大豆分离蛋白的热性质和空间构象进行分析，结合对大豆分离蛋白表面疏水性测定，探讨大豆蛋白的热性质和空间构象对其表面疏水性的影响，进而改善大豆分离蛋白的功能性质，为其在食品中的实际应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大豆：品种为东农46、黑农46、皖豆24、五星4、冀 NF58、中黄13。

Lowry法蛋白质含量测定试剂盒：上海荔达生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）：美国Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、HCl、NaOH均为分析纯。

低温高速离心机：美国Beckman公司；PHSJ-4A型实验室pH计：中国上海雷磁公司；722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PE Pyris6差示扫描量热仪：美国PULUSTA.XT公司；F-4500荧光分光光度计：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆分离蛋白的制备

原料大豆经去皮、粉碎后过60目筛，然后在40℃条件下采用正己烷萃取以制备脱脂豆粕。将脱脂豆粕按1∶15的质量比与水混合，用2 mol／L NaOH调pH值至8.0，搅拌l.5 h后，将其悬浮液在4℃条件下10 000×g离心30 min，取上清液用2mol／L HCl调pH值至4.5。静置后在4℃条件下6 000×g离心30 min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol／L NaOH调pH值至7.0。再在4℃条件下10 000×g离心30 min，除去少量的不溶物，将其蛋白溶液冷冻干燥后粉碎即得粉末状大豆分离蛋白。蛋白质含量的测定依据GB／T 5009.5—2010。

1.2.2 蛋白质表面疏水性的测定

参考Kato等［4］的方法。采用ANS荧光探针法。分别称取0.025 g不同品种蛋白样品溶于50 mL磷酸盐缓冲液（0.01 mol／L，pH7.0）中，在室温条件下搅拌1.0 h，然后在10 000×g离心30 min，取上清液用Lowry法测定蛋白浓度，并用同一磷酸盐缓冲液依次稀释（浓度0.005～0.5 mol／mL）后，取不同浓度样品的溶液4 mL，分别加入40μL浓度为8 mmol／L的ANS溶液（用0.01 mol／L，pH7.0的磷酸盐缓冲液配制），经振荡后静置3 min，再测定样品的荧光强度（FI）。试验中激发波长λex＝370 nm，发射波长λem＝490 nm，夹缝为5 nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数（So）。

1.2.3 蛋白质热性质的测定

依据Tang等［5］的方法。利用PE Pyris 6-DSC热力分析仪测定大豆分离蛋白样品的热力学特性。称取5 mg的样品放入铝盒中，再向其中加入10μL的0.01mol／L的磷酸缓冲溶液（pH 7.0），压盘密封，室温条件下放置6 h；将平衡好的样品铝盒放入到DPS操作台左侧，空白铝盒放置在右侧。温度扫描范围：20～120℃；升温速率：10℃／min；在120℃保持1 min；随后从120℃降温至20℃，降温速率：30℃／min。记录此过程中大豆分离蛋白的变性温度（T d）和变性焓变（ΔH）。所有的试验结果为3次测定值的平均值。

1.2.4 蛋白质空间构象的分析

参考尹寿伟［6］的方法。采用F-4500荧光分光光度计测定大豆分离蛋白的内源性荧光光谱（色氨酸荧光光谱）。将大豆分离蛋白样品分别分散于0.01 mol／L磷酸缓冲液（pH 7.0）中，配制蛋白质量浓度为0.15 mg／mL。荧光发散光谱分析以蛋白质分子内部的色氨酸荧光基团为探针，为了降低酪氨酸的贡献，荧光光谱激发波长为290 nm，发散光谱扫描范围为300～400 nm，激发狭缝和发射狭缝宽均为5 nm。

1.2.5 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均数x±s。数据统计分析采用SPSS V17.0软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，P＜0.05为显著性差异，采用Origin8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 大豆蛋白含量

由表1可知，采用不同品种的大豆所提取分离蛋白的蛋白质量分数均高于90%，纯度较高，可用于本试验中蛋白质组成和性质的测定。

表1 不同品种大豆分离蛋白的蛋白含量（x±s，n＝3）

2.2 不同品种大豆分离蛋白的表面疏水性

图1为不同品种大豆分离蛋白的表面疏水性。由图1可以看出，6种大豆分离蛋白的表面疏水性也存在显著性差异（P＜0.05），表面疏水性数值在650.44%与793.16%之间，且从大到小顺序依次为：793.45（东农46号）＞780.44（皖豆24号）＞767.71（黑农46号）＞675.64（五星4号）＞663.57（中黄13号）＞650.43（冀NF58）。这表明不同品种大豆分离蛋白的表面疏水性不同，可能由于不同蛋白质的分子结构、构象及其热性质不同，导致其表面疏水性的差异［7］。

图1 不同品种大豆分离蛋白的表面疏水性

2.3 大豆分离蛋白热性质对表面疏水性的影响

蛋白质的热力学分析就是通过测量蛋白质在连续升温破坏其高级结构过程中所需的能量变化情况和变性温度。通过计算示差扫描量热仪（DSC）谱图中最大峰对应的温度和峰面积可分别确定变性温度（T d）及变性焓ΔH）。变性温度反应蛋白质的热稳定性，而变性焓则反映蛋白质分子的疏水性或亲水性，同时也表征蛋白质分子的聚集程度（反映有序结构所占比例）［8］。

6种品种的大豆分离蛋白的热力学分析结果见表2。由表2可知，6个品种大豆分离蛋白中7S球蛋白和11S球蛋白的ΔH值和Td值之间存在显著性差异；6种品种大豆分离蛋白中11S球蛋白的Td值和ΔH值均高于7S球蛋白，也说明11S球蛋白的热稳定性高于7S球蛋白。6种分离蛋白中7S球蛋白的Td值在74.2～78.1℃之间，11S球蛋白的Td值介于85.0～93.3℃之间，结合不同品种分离蛋白的表面疏水值对其分析，发现7S球蛋白与11S球蛋白的Td值与表面疏水性存在显著的负相关，相关系数分别为 -0.923（P＜0.01）和 -0.893（P＜0.05），说明大豆蛋白的热稳定性越好，其表面疏水性越小；7S球蛋白的ΔH值在22.41～51.26 J·g-1之间，差异幅度较大，以冀NF58最高，中黄13号次之，东农46号最低；11S球蛋白的ΔH值在35.68～67.53 J·g-1之间，其中中黄13号和冀NF58的ΔH值相对较高，东农46号和皖豆24号的ΔH值较低，通过相关性分析得知，不同品种的大豆分离蛋白的7S球蛋白与11S球蛋白的ΔH值与表面疏水性也存在显著负相关，相关系数分别为 -0.874（P＜0.05）和 -0.876（P＜0.05），即7S球蛋白与11S球蛋白的ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白质的有序结构所占比例越低，分子相对伸展，分子内部的疏水性残基暴露较多，导致蛋白质具有相对较大的表面疏水性。

表2 6种分离蛋白的热力学分析

2.4 大豆分离蛋白空间构象对表面疏水性的影响

基于前面对大豆分离蛋白热稳定性和表面疏水性研究的基础上，采用内部荧光光谱（色氨酸荧光光谱）在三级结构层面上来解析6种蛋白的构象差异。6种大豆分离蛋白的内部荧光光谱如图2所示。本研究采用290 nm作为激发波长，所得图谱主要是色氨酸（Try）为发射基团的荧光光谱，表征色氨酸微环境极性的变化，是一种在三级结构水平反映蛋白质构象变化的比较灵敏的技术手段。荧光峰红移表明荧光发射基团（Try）更加暴露于溶剂，也就是荧光发射基团的微环境极性增加，蓝移则表明发射基团（Try）位于更为疏水的微环境中，而荧光峰强度下降与荧光猝灭相关联的（猝灭剂存在于溶剂或蛋白质分子内部）［9］。图2所示，6种大豆分离蛋白具有典型的色氨酸发射光谱，6种分离蛋白的荧光峰分布在335.8～339 nm之间，依次为339 nm（东农46号）＞338.4 nm（皖豆24号）＞337.6 nm（黑农46号）＞337.2 nm（五星4号）＞336.6 nm（中黄13号）＞335.8 nm（冀NF58），荧光峰峰位之间存在显著性差异（P＜0.05），并且不同品种的大豆分离蛋白随着荧光峰峰位数值和峰强越大，所具有的表面疏水性越高。分析原因可能是由于6种大豆分离蛋白的色氨酸光谱荧光峰均大于330 nm，色氨酸残基部分暴露于亲水区［10］，荧光峰峰位数值越大（发生红移），峰强越高，色氨酸残基的微环境极性越强，埋藏在内部的疏水基团的暴露是导致表面疏水性增大的主要原因［11-13］，这与大豆品种密切相关。

图2 6种大豆分离蛋白的荧光光谱图

3 结论

采用差示量热扫描（DSC）法和荧光光谱法对不同品种大豆分离蛋白的热性质和空间构象进行分析，结合对大豆分离蛋白表面疏水性测定，探讨大豆蛋白的热性质和空间构象对其表面疏水性的影响。通过差示量热扫描发现不同品种的大豆分离蛋白的7S球蛋白与11S球蛋白的Td值、ΔH值与表面疏水性存在显著负相关，即7S球蛋白与11S球蛋白的T d值、ΔH值越小，表面疏水性越大。分析原因是ΔH值越低，反映蛋白质的有序结构所占比例越低，分子相对伸展，分子内部的疏水性残基暴露较多，导致蛋白质具有相对较大的表面疏水性。荧光光谱表明6种大豆分离蛋白具有典型的色氨酸发射光谱，荧光峰峰位之间存在显著性差异，并且不同品种的大豆分离蛋白随着荧光峰峰位数值和峰强越大，色氨酸残基的微环境极性越强，表面疏水性越高。这与大豆品种密切相关，埋藏在内部的疏水基团的暴露是导致表面疏水性增大的主要原因。

［1］Riblett A L，Herald T J，Schmidt K A，et al.Characterization ofβ-conglycinin and glycinin soy protein fractions from four selected soybean genotypes［J］.Agric Food Chem，2001，49：4983-4989

［2］Chuan-He Tang，Yan Jiang.Modulation ofmechanical and surface hydrophobic properties of food protein films by transglutaminase treatment［J］.Food Research International，2007，40：504-508

［3］Sorgentini D A，Wagner JR，Anon M C.Effects of thermal treatment of soy protein isolate on the characteristics and structure-function relationship of soluble and insoluble fractions［J］.JAgric Food Chem，1995，43（9）：2471-2479

［4］Kato A，Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probemethod and its correlation with surface properties of proteins［J］.Biochem Biophy Acta，1980，624（1）：13-20

［5］Tang CH，Choi SM，Ma C Y.Study of thermal properties and heat-induced denaturation and aggregation of soy proteins by modulated differential scanning calorimetry［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2007，40：96-104

［6］尹寿伟.芸豆蛋白的物化修饰及相关构效机理研究［D］.广州：华南理工大学，2009

［7］周筠梅，周军贤.蛋白质表面疏水性的研究［J］.生物物理学报，1996（4）：72-76

［8］Ma C Y，Harwallkar V R.Thermal Analysis of Food Proteins［J］.Adv Food Nutr Res，1991，35：317

［9］Pallarès I，Vendrell J，Avilès FX，et al.Amyloid fibril formation by a partially structured intermediate state of a-chymotrypsin［J］.Molecular Biology，2004，342：321-331

［10］Vivian JT，Callis P R.Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins［J］.Biophys，2001，80（5）：2093-2109

［11］Lin L H，Chen K M.Preparation and surface activity of modified soy protein［J］.Applied Polymer Science，2006，102（4）：3498-3503

［12］Matemu A O，Kayahara H，Murasawa H，et al.Improved emulsifying properties of soy proteins by acylation with saturated fatty acids［J］.Food Chemistry，2011，124：596-602

［13］Krause JP，Mothes R，Schwenke K D.Some physicochemical and interfacial properties of native and acetylated legumin from faba beans（Vicia faba L）［J］.Agric Food Chem，1996，44（2）：429-437.