陈娜，陈可可，费建枫，陈小娥，方旭波，2，*，胡道亨

（1.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山316004；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江舟山316004；3.舟山市普陀新兴医药化工有限公司，浙江舟山316111）

虾加工下脚料浓缩蛋白粉制备工艺研究

陈娜1，陈可可1，费建枫1，陈小娥1，方旭波1，2，*，胡道亨3

（1.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山316004；2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江舟山316004；3.舟山市普陀新兴医药化工有限公司，浙江舟山316111）

以虾加工下脚料所采肉为原料，利用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶进行水解，以水解度为指标筛选得木瓜蛋白酶为最佳酶，并采用L9（34）正交试验进一步研究木瓜蛋白酶酶解的最佳工艺条件。结果为固液比为1∶2.5，pH=7.5，酶用量6 000U/g，在55℃下酶解5.0 h，其水解度可达28.12%；将水解液经离心过滤、浓缩、喷雾干燥制得浓缩蛋白粉，经检测其所含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白质90.16%，可作为调味品、作为功能食品的补充成分或饲料添加。

虾加工下脚料；木瓜蛋白酶；水解；正交试验；浓缩蛋白

我国虾产量丰富，加工出口的主要包括对虾、淡水小龙虾的虾仁汤料等。近年来，随着水产企业的增多，加工过程中伴随着产生的下脚料也越来越多。经调查发现，浙江以海水虾或淡水虾为主要原料的生产企业在处理这些下脚料时，一部分作为废料外售，每吨几百元不等，或者运送到养殖场烘干粉碎作为饲料，还有很多未来得及处理的下脚料由于堆砌一处发霉腐烂，最终直接运往垃圾场。而这些副产物含有丰富的蛋白质、虾红素、不饱和脂肪酸等营养物质，含有钙、镁、磷等矿物质盐类以及脑磷脂、卵磷脂、类胡萝卜素、碳水化合物、纤维素、维生素等营养成分[1]。虾副产物主要是指对原料虾筛选后加工成虾仁、虾尾及整肢虾等产品的下脚料，包括大量无法加工利用的低值小虾、虾壳、虾足及虾头，这些下脚料含有许多残肉。目前，将少量虾头、虾壳等粉碎后掺入鱼粉作为饲料、诱饵，以及用虾头、虾壳提取功能性营养物质已有许多报道。下脚料中低值虾类、小虾等残留大量虾肉，将这些残留虾肉加以利用具有更高的利用价值，同时采肉后的虾壳虾头可做进一步处理。因此，本试验利用蛋白酶水解[2]下脚料所采肉制成浓缩蛋白粉，同时优化其工艺条件，为企业实现废料资源化利用提供参考，而且可减少各种下脚料、废弃物对环境的污染。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

虾加工下脚料：舟山市普陀新兴医药化工有限公司提供。

胰蛋白酶为广州正一科技有限公司分销提供，木瓜蛋白酶为广州华琪酶制剂厂提供，碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶均为广西南宁庞博生物工程有限公司提供；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

分析天平（万分之一）：湘西天平仪器厂；HH-6系列恒温水浴锅：金坛市荣华仪器制造有限公司；JR-22实验室用绞肉机：诸城市汇丰食品机械有限公司；RE-52CS-1型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；PHS-3B精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；78-1型磁力加热搅拌器：金坛市环宇科学仪器厂；TDL-5-A型离心机：上海安亭科学仪器厂；喷雾干燥机：锡山市林州干燥机厂。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的筛选

拣出虾加工下脚料中混杂的石块、金属等异物，清洗，沥水，绞肉，经预处理后冷冻备用。取一定质量原料一夜自然解冻[3]后，调成料液比1∶2.5，在恒温水浴锅中预热至50℃，调节至所需的pH（见表1），分别加入菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶进行酶解，添加量6 000U/g，酶解4 h后，90℃水浴中灭酶15min，3 000 r/min离心20min，取上清液进行水解度测定。

表1 商品酶的相关参数表Table1 Related parameters of the table of commodity enzyme

1.3.2 单因素实验

用所筛选酶进行水解，分别研究温度、pH、酶解时间和酶用量对水解度的影响，

1.3.3 正交试验

以水解度为评价指标，考察酶解效果[4]，研究温度、pH、酶解时间、酶用量4个因素，设计L9（34）正交试验，因素水平见表2，确定最佳的水解条件。

表2 正交试验因素设计表Table2 Factors of orthogonal test design table

1.3.4 浓缩蛋白粉的制备

在正交试验所得最佳条件下进行酶解，灭酶后离心过滤，取上清液浓缩，喷雾干燥[5]制得浓缩蛋白粉。

1.3.5 测定方法

直接干燥法测定水分[6]，550℃灼烧法测灰分[6]，凯式定氮法测粗蛋白含量[7]，索式抽提法测粗脂肪含量[6]，用甲醛滴定法[6]测氨基氮含量，微量凯式定氮法测总氮含量[6]，计算其水解度，计算公式如下：

DH=酶解液中的游离氨基氮含量/原料中的含氮量×100%

2 结果与讨论

2.1 酶的筛选结果

在一定条件下，用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶进行酶解实验。结果见表3。

表3 4种酶水解效果比较Table3 The comparation of hydrolysis effect of four enzymes

从表2可以看出，木瓜蛋白酶的水解效果最好，可达26.73%，其次是胰蛋白酶，碱性蛋白酶，菠萝蛋白酶，考虑到木瓜蛋白酶资源丰富，价格低廉，且水解能力好，水解液苦味较弱，更能适应实际生产的需要等优点，故本实验选择木瓜蛋白酶进行水解。

2.2 单因素实验

2.2.1 温度对水解度的影响

在pH=7.0、料液比1∶2.5、时间4.0 h、酶用量6 000U/g的条件下，在不同温度下进行水解，结果见图1。

从图1可以看出，从45℃升至60℃，水解度呈现明显上升的趋势，达到60℃后曲线虽有增加但较为缓和，可能因为在一定温度范围内，酶的活性比较高反应速率较大，超出这个范围酶活降低，认为最适温度范围为60℃～65℃，考虑到提高温度对应着生产成本的提高，故选择60℃作为温度单因素的最佳温度。

图1 水解温度对水解度的影响Fig.1 Effects of temperature on DH of hydrolysate

2.2.2 pH对水解度的影响

在料液比1∶2.5、时间4.0 h、酶用量6 000U/g的条件下。分别用1.0mol/LHCL或NaOH调节pH至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5进行水解，结果见图2。

图2 pH对水解度的影响Fig.2 Effects of pH on DH of hydrolysate

由图2可知，蛋白质的水解率在pH=7.5时达到最大，而当pH大于或小于7.5时水解度下降较明显，故初步将pH=7.5作为pH对水解度单因素中的最优选。

2.2.3 水解时间对水解率的影响

在pH=7.0、温度为60℃、酶用量6 000 U/g、料液比1∶2.5的条件下，分别水解2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 h，测其水解度，结果见图3。

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 Effects of time on DH of hydrolysate

从图3可以看出，增加酶解反应时间，有利于反应的充分进行；反应时间达到4.5 h测得的水解度几乎呈现线性增长，说明在此段时间里酶解反应较快速的进行，而达到5.5 h后，水解度变化不明显，可能由于随着反应的进行，底物浓度减小且伴随着水解产物的影响，使得酶与底物接触受阻，导致酶解反应的速率降低。故初步将酶解时间确定为5.5 h。

2.2.4 酶用量对水解度的影响

在pH=7.0、料液比1∶2.5、时间4.0 h、考察木瓜蛋白酶不同添加量对水解度的影响，结果见图4。

图4 酶用量对水解度的影响Fig.4 Effects of amount of enzyme on DH of hydrolysate

由图4可看出，当底物量一定时，在酶饱和底物之前，反应速率随酶浓度的变化而变化[8]，蛋白质的水解度增大，酶用量从3 000 U/g到6 000 U/g时，曲线增长明显，达到6 000U/g后，由于底物达到饱和，再增加酶量水解度变化不明显，因此可以确定使得底物饱和的酶用量大致在6 000U/g～7 000U/g之间，综合考虑实验指标和加工成本，选择6 000U/g较为合适。

2.3 正交试验

正交试验结果如表4所示。

表4 正交试验结果Table4 Orthogonal test results

通过对正交试验结果进行直观分析，可知，因素B的极差最大，其次是C，D，A，由此可见决定实验结果因素的主次顺序为B＞C＞D＞A，其最佳组合是A2B2C3D2。比较之下，因素A的极差较小，对水解度的影响不大，且考虑到节约成本，故选择温度为55℃。近来有一些学者也指出，在使用酶时，为了避免酶所产生的一些潜在的危害，所以尽可能降低酶的处理时间[9]，故时间选择5.0 h更加合适，即最终优化条件为A1B2C2D2，即初始温度55℃、pH=7.5，酶用量6 000U/g，酶解时间5.0 h。

2.4 验证试验

在以上得到的优化工艺条件下，进行验证实验，实验重复3次，得到蛋白质水解度为（28.12±0.15）%，所以通过正交实验得到的最优工艺条件具有一定的科学性、可靠性。

2.5 浓缩蛋白粉主要成分分析[10]

制得的浓缩蛋白粉含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白质90.16%，且虾味浓郁，鲜味十足。与几种常见蛋白制品比较分析，结果见表5。

表5 浓缩蛋白粉制品与几种常见蛋白产品营养成分比较Table5 The nutrition comparison of enrichment protein powder products and several protein products

3 结论

以水解度为指标，从4种常用酶筛选出木瓜蛋白酶最适合用于本试验。通过正交试验，得到最佳优化条件为，当固液比为1∶2.5，pH=7.5，酶用量6 000U/g，在55℃下酶解5.0h，此时水解度可达28.12%，将水解液离心过滤，浓缩，喷雾干燥制得浓缩蛋白粉，经检测其所含水分3.21%、灰分3.05%、脂肪3.26%、蛋白质90.16%，且制品虾味浓郁、色泽较好，粉末状颗粒，非常适合作为蛋白强化剂或风味料的填充剂等。

[1]陈天忠,姚歆和,文利新.虾头﹑虾壳资源综合利用研究进展[J].湖南饲料,2006(4):35-36

[2]闫亚梅,卢长润.酶法水解牡蛎肉及其制品的研究[J].中国调味品,1995(5):5-7

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A Method of Concentrating Protein from Shrimp Using Enzyme Preparation

CHEN Na1，CHEN Ke-ke1，FEI Jian-feng1，CHEN Xiao-e1，FANG Xu-bo1，2，*，HU Dao-heng3
（1.School of Food Science and Pharmacy，ZheJiang Ocean University，ZhouShan 316004，Zhejiang，China；2.Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology，Zhoushan 316004，Zhejiang，China；3.Zhoushan Putuo Xinxing Pharmachem Co.，LTD.，Zhoushan 316111，Zhejiang，China）

Rate of hydrolysis degree of for the papain was used as an index with processing shrimp as the raw material，trypsin was screened out from papain，pineapple proteinase，alkali protease and trysin.The technological parameter of hydrolysis degree was optimized by L9（34）orthogonal experimental design，the result for the solid-liquid ratio is1∶2.5，pH=7.5，add enzyme quantity6000U/g in 55℃enzyme solution under 5.0h，the hydrolysis degree can amount to 28.12%.will the hydrolyzed centrifuge，concentration，the spray drying the enrichment protein powder，measuring the contains moisture content3.21%3.05%，ash content，3.26%fat，protein 90.16%，can be as a condiment，feed additives，or as a complement to the functional food ingredients。

shrimp processing scraps；papain；hydrolysis；the orthogonal experiment；protein concentrate

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.010

2012-06-25

舟山市科技局项目（10332）；浙江海洋学院大学生创新性实验项目资助

陈娜（1990—），女（汉），研究生，研究方向：海洋资源利用。

*通信作者：方旭波（1972—），男（汉），副教授，博士。