刘宪夫，孙利芹，王长海

（1.南京农业大学海洋生物学重点实验室，江苏南京210095；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005）

小球藻油脂不同提取方法的比较

刘宪夫1，2，孙利芹2，王长海1，*

（1.南京农业大学海洋生物学重点实验室，江苏南京210095；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005）

小球藻因其高的油脂含量和生长特性成为生物柴油研究的重要微藻资源之一，而研究表明油脂提取方法的不同通常直接关系到生物柴油的质量。研究了索氏提取、有机溶剂浸提两种油脂提取方法及不同细胞前处理方法对小球藻油脂提取率的影响，并比较了不同方法提取的油脂组成成分差异。结果表明，在不同的提取方法中，油脂得率、油脂中中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸比例及脂肪酸提取纯度各不相同。其中，氯仿-甲醇浸提法是一种简便快捷高效的油脂提取方法，其油脂得率为（22.40±0.89）%，中长链脂肪酸（C14-C22）比例为85.84%；索氏提取法中无水乙醇作为提取溶剂获得的得率最高为（24.37±0.21）%，石油醚提取的油脂脂肪酸成分最多，达到10种。

小球藻；油脂提取；气相色谱

随着全球石化燃料的日益枯竭，可再生资源的寻求显得尤为重要。油脂是一类重要的可再生资源，微藻油脂与植物油脂相似，可代替植物油脂，还可以用来生产生物柴油。微藻的能源化利用有望成为“后石油时代”破解能源危机的一把金钥匙[1-2]。近年来，从微藻中制备生物柴油的研究也引起了我国政府、科研机构和企业的重视，被列为科技部“973”和“863”计划的重点项目之一。目前对产油藻的研究主要有葡萄藻（Botryococcus braunii）、小球藻（Chlorella pyrenoidosa）等[3]。其中以小球藻为原料生产的生物质燃油非常宜于柴油发动机的燃烧，同时由于小球藻的高含油量和生长迅速的特征，因此被认为是最有工业化潜力的生物柴油的重要生产藻株之一[4-5]。目前从微藻中提取油脂的方法主要有碾磨法、酸水解法、索氏抽提法和加热回流法等[6]。早期研究表明[7]，对于相同的原料采用的提取方法不同，所获得的油脂提取率是不同的。生物柴油通常是指由中长链脂肪酸形成的单烷基酯，即脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的[8]。因此探讨油脂提取方法对油脂脂肪酸组成的影响，对优质微藻生物柴油的制备有重要意义。本研究即在上述背景下，以小球藻为材料，考察了不同提取方法（索氏提取法和有机溶剂浸提法）及小球藻细胞不同前处理方法对油脂提取率和脂肪酸组成的影响，旨在寻找到一种油脂得率较高、可以制备优质生物柴油的油脂提取方法，为微藻能源化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小球藻（Chlorella pynenoidosa），原种由中国海洋大学微藻种质库（MACC）提供，经进一步分离纯化后由烟台大学海洋生化工程研究所保存。

石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、异丙醇、环己烷、氯仿、甲醇、甲苯均为分析纯。脂肪酸甲酯标准品为Sigma公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 小球藻的培养与采收

小球藻培养用海水取自烟台大学近海，经过滤、高温灭菌后使用。采用f/2培养液，室温（22±1）℃，光照2 500 lx（日光灯），连续充气培养。在细胞生长至指数生长末期（培养至7 d～8 d左右）离心采收，低温烘干封口于干燥器中保存备用。

1.2.2 油脂提取方法

1.2.2.1 索氏提取法

准确称取小球藻藻粉0.2 g放入滤纸包中，称重得m1，放入索氏提取器中。分别选用石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、异丙醇、环己烷8种单一有机溶剂进行提取，直至提取到无色，取出滤纸包烘干至恒重，称重得m2，m1与m2之差即为油脂重量，按公式1计算油脂得率。旋转蒸发有机溶剂得油脂备用。每个实验重复3次。

1.2.2.2 有机溶剂浸提法

准确称取小球藻藻粉m10.2 g放入50mL离心管中，分别采用氯仿-甲醇（2∶1）、丙酮-石油醚（1∶1）、乙醚-石油醚（1∶1）三种溶剂组合进行提取，3 h后离心转移上层有机溶剂，重新加入溶剂再次抽提，重复三次。小球藻藻粉残渣烘干至恒重，称重得m2，m1与m2之差即为油脂重量，按公式1计算油脂得率。分别合并有机溶剂相并旋干得油脂备用。每个实验重复3次。

1.2.2.3 小球藻细胞前处理方法[9]

酸热法：准确称取小球藻藻粉m10.2g，加入4mol/L盐酸，震荡混匀，室温下放置30min，，然后沸水浴3min，立即放于-20℃速冷。

超声法：准确称取小球藻藻粉m10.2 g，加入10mL蒸馏水振荡混匀后，超声处理，功率200W，全程时间20min，其中脉冲时间10 s，间隔时间4 s。

酸热耦合超声波法：准确称取小球藻藻粉m10.2g，先按上述酸热法处理，后再按上述超声法处理。

上述三种方法处理后的小球藻藻粉采用氯仿-甲醇（2∶1）进行油脂浸提，浸提方法同1.2.2.2。

1.2.3 油脂脂肪酸组成分析

1.2.3.1 样品甲酯化

精确称取5mg油脂提取物中加入带塞试管中，加入3mL石油醚∶甲苯（1∶1）的混合溶剂，待油脂溶解，加入3mL 0.4mol/L的KOH-CH30H溶液，混匀，室温静置10min，加蒸馏水至瓶颈部，静置，取上层液分析[10]。

1.2.3.2 气相色谱分析

采用岛津GC-2010气相色谱仪，氢火焰离子化检测器，DB-5毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。升温程序：150℃保留1min，以10℃/min升至250℃，保留40min。进样口、检测器的温度为290℃。载气为高纯度氮气，流速为9.6mL/min，进样量0.8μL。以面积归一化法计算各脂肪酸组分的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 油脂提取方法比较

2.1.1 不同提取方法下小球藻油脂得率的比较

表1为采用不同方法提取小球藻油脂的油脂得率。

表1 索氏提取法、浸提法油脂得率Table1 The extraction efficiency of Soxhlet extraction and extract approach

从表1中可以看出在索氏提取法中，无水乙醇的提取效果最好，油脂提取得率达到24.37%，这和马帅等[7]运用乙醇法对微藻油脂提取的结果相似。其次为乙酸乙酯、异丙醇。环己烷的油脂得率也达到了15.08%，油脂提取得率较小的是正己烷和石油醚。实验中采用的不同溶剂提取油脂实验重复率都较好，说明各有机相对小球藻中粗脂的提取较稳定。不同溶剂提取的油脂的颜色不同，石油醚、正己烷提取的油脂呈现黄色，油脂提取率较大的无水乙醇、乙酸乙酯等油脂呈现绿色，可能因为有些溶剂对色素等提取效果较好造成的，因而采用不同的溶剂，油脂提取得率相差较大。

采用混合溶剂浸提法提取小球藻油脂结果（表1）显示，氯仿-甲醇的提取效果最好，提取率达到22.40%。丙酮-石油醚提取效果次之，油脂提取率为17.81%。乙醚-石油醚提取油脂得率较差，仅为12.61%。

与索氏提取方法相比较，氯仿-甲醇浸提法所获得的油脂提取率（22.4%）仅次于索氏提取中的无水乙醇，与乙酸乙酯提取率相当，但这种现象并没有发生在乙醚-石油醚、丙酮-石油醚混合溶剂中。但由于索氏提取法耗时较长，操作繁琐，而且需要的样品量较大，因而不适用于对微藻细胞中的油脂含量实行在线监测。而溶剂浸提法中，氯仿-甲醇的提取率高，且操作步骤相对简单，适用于微藻生长过程中对其细胞油脂含量实现在线监测。

2.1.2 不同小球藻细胞前处理方法的比较

表2为小球藻细胞经不同前处理后采用氯仿-甲醇浸提的结果。

表2 不同小球藻细胞前处理方法的比较Table2 The comparison of different Pre-treatment methods on Chlorella cells

数据分析显示：对小球藻细胞经过前破碎处理，小球藻的油脂得率有一个提升，但提升效果并不是很明显。其中酸热超声耦合时对油脂的提取效果最好，油脂得率为24.58%。超声法比酸热法油脂得率稍高。

2.2 油脂脂肪酸组成分析

2.2.1 不同油脂提取方法中油脂脂肪酸组成分析

两种提取方法下提取的小球藻粗油脂脂肪酸组成分析见表3和表4。

由数据分析可知：不同提取方法下小球藻油脂的脂肪酸组成差别不是很大，不同方法提取的小球藻的油脂都主要由C16、C18、C20脂肪酸组成。C16脂肪酸中C16∶0较多的存在在，占总脂肪酸的12.04%～26.92%，C16∶1占总脂肪酸的5%左右。C18脂肪酸中C18∶0和C18∶1含量较多，绿藻纲微藻最主要的脂肪酸C18∶3含量很少，有的提取方法甚至都没有检测到。在C20脂肪酸中小球藻属中藻类不应具有的二十碳五烯酸（C20∶5）却占有很大比例，占到总脂肪酸的5.53%～26.01%，这与冯福应等[11]的研究结果比较相似，与蒋敏霞[12]等研究结果有所不同，这可能与小球藻的藻种及培养条件不同有关。C8-C12等短链脂肪酸以及C22、C24长链脂肪酸含量很少，有的提取方法甚至没有检测到。

表3 索氏提取法提取油脂脂肪酸组成分析（占总脂肪酸含量%）Table3 The fatty acid composition analysis of the lipin cxtracted from Soxhlet extraction

表4 浸提法和藻细胞不同前处理提取油脂的脂肪酸组成分析（占总脂肪酸含量%）Table4 The fatty acid composition analysis of the lipin from extract approach and different Pre-treatment methods on Chlorella cells

续表4 浸提法和藻细胞不同前处理提取油脂的脂肪酸组成分析（占总脂肪酸含量%）Continue table4 The fatty acid composition analysis of the lipin from extract approach and different Pre-treatment methods on Chlorella cells

在提取方法相同溶剂不同的情况下，提取获得的油脂组成也有所差别。在索氏提取法中，正己烷、石油醚提取的脂肪酸成分较多，分别为9种和10种，异丙醇、丙酮提取物中脂肪酸的成分比较少，都为5种，其它溶剂提取物中脂肪酸的成分为6种～8种。在浸提法中，乙醚-石油醚提取物中有最多的9种脂肪酸成分，超声处理、酸热处理、酸热耦合超声处理提取的油脂中脂肪酸成分较少，均为6种，而未经处理、丙酮-石油醚提取物中都含有8种脂肪酸成分。综上，在索氏提取法和浸提法中，只要单一或者混合提取溶剂中含有石油醚，提取的油脂中就含有较多脂肪酸成分，与其它有机溶剂提取的油脂相比，多了C10∶0、C12∶0两种或者其中一种脂肪酸。造成这种结果的原因可能与石油醚的极性小，酯类、醇类的极性大有关。生物柴油是由中长链脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的，石油醚作为提取溶剂虽然提取出较多的脂肪酸成分，但提取出的短链脂肪酸（C10、C12）并不利于生物柴油的生产。

不同方法和提取溶剂所提取的油脂中各脂肪酸所占总脂肪酸比例有所差别。在索氏提取法中，正己烷作为提取溶剂，C8∶0、C22∶0、C24∶0的占总脂肪酸比例最高，C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶5占总脂肪酸最高比例分别出现在丙酮、异丙醇、石油醚、乙酸乙酯作为提取溶剂的方法中，比例分别达到：5.79%、8.43%、32.83%、26.01%。在浸提法中，C10∶0、C12∶0、C18∶3在乙醚-石油醚作为提取溶剂提取的油脂中比例最高，C14∶0、C16∶0占总脂肪酸最高比例分别出现在丙酮-石油醚、酸热处理方法中，比例分别达到：4.30%、26.92%。可见根据所需要的脂肪酸可选择不同的油脂提取方法。

2.2.2 不同油脂提取方法中油脂中长链脂肪酸（C14-C22）组成分析

由于生物柴油通常是指由中长链脂肪酸形成的单烷基酯，即脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的，因此提取的油脂中中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸的比例关系到生物柴油的燃烧性能。由表3和表4中可以看出：在不同提取方法下中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸的比例可达到68.4%～91.08%，中长链脂肪酸（C14-C22）比例较高，这说明用小球藻油脂制备生物柴油的思路是正确的。在索氏提取法中，中长链脂肪酸（C14-C22）比例可达到69.35%～87.82%。其中异丙醇作为提取溶剂的比例最高为87.82%，无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚次之，乙醚最低，为69.35%。在浸提法中，中长链脂肪酸（C14-C22）比例可达到68.4%～91.08%。藻粉经过酸热处理后最高，为91.08%，未经处理比例次之，达到85.84%。乙醚-石油醚作为浸提溶剂比例最低，仅为68.4%。综上，在索氏提取法异丙醇作为提取溶剂以及浸提法中藻粉未经处理、藻粉酸热处理方法下，中长链脂肪酸（C14-C22）比例都比较高，都高于85.8%。可见，藻粉未经处理，采用氯仿-甲醇作为提取溶剂的浸提法所提取的油脂是适用于生物柴油生产的。

2.2.3 不同油脂提取方法粗提物中脂肪酸纯度分析

由于对不同提取方法提取的油脂进行甲酯化时称取的油脂重量相同，因此，进行气相色谱分析后，脂肪酸峰面积大小可代表单位重量粗油脂中脂肪酸含量的差异。由表3和表4中，在索氏提取法中，正己烷、无水乙醇、石油醚等作为提取溶剂时峰面积较大，表明这些方法提取的粗油脂中所检测脂肪酸的含量较高。在浸提法中，小球藻藻粉未经前处理，粗提物油脂中所检测脂肪酸的含量较高，而经过酸热、超声、酸热耦合超声处理后，粗油脂中所检测脂肪酸的含量均有明显下降。乙醚-石油醚、丙酮-石油醚均没有采用氯仿-甲醇作为提取溶剂检测出的脂肪酸的含量高。综上，浸提法中，小球藻不经处理，采用氯仿-甲醇作为提取溶剂所提取的粗油脂中含有较多含量的脂肪酸。

3 结论

微藻油脂的提取过程对生物柴油的生产非常重要。不同方法提取微藻油脂需同时考虑到两个因素：油脂得率和油脂脂肪酸成分，因为这关系到生物柴油的产量和燃烧性能。在索氏提取法中无水乙醇作为提取溶剂提取油脂，虽然油脂得率较氯仿-甲醇稍高，但中长链脂肪酸（C14-C22）比例不及氯仿-甲醇直接浸提法提取的油脂。另外考虑到索氏提取法耗时较长，操作繁琐，而且需要的样品量较大。氯仿-甲醇浸提法所获得的油脂提取率虽次于索氏提取中法中的无水乙醇，但提取物经过气相分析发现：该方法提取的油脂脂肪酸成分、中长链脂肪酸（C14-C22）比例、粗提物中脂肪酸纯度均非常适于生产生物柴油。而小球藻藻粉经过不同前处理与未经处理相比，油脂得率没有明显提高，粗提物中脂肪酸纯度反而有了明显降低。综上，结合不同油脂提取方法的油脂得率及脂肪酸组成，氯仿-甲醇直接浸提法是一种适于生物柴油生产的小球藻油脂提取方法。

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The Comparison of Different Extraction Method of Lipin from Chlorella

LIU Xian-fu1，2，SUN Li-qin2，WANG Chang-hai1，*
（1.Nanjing Agricultural University Marine Biology Key Laboratory，Nanjing210095，Jiangsu，China；2.Shandong Yantai University Marine Institute，Yantai264005，Shandong，China）

Chlorella has become one of the important microalgae resources for biodiesel research because of its high fat content and growth characteristics，and there is a lot of research showing that the lipin extraction method is usually directly related to the quality of biodiesel.We investigate the Soxhlet extraction and organic solvent extraction of lipin extraction method and the influence of extraction rate of chlorella lipin extracted by different pre-cell approach methods，and compared the composition differences of lipin extracted by different methods.The results show that the different extraction methods result in different lipin yield，different ratio of long-chain fatty acids（C14-C22）to total fatty acids and different extract purity of fatty acids.Among them，chloroform-methanol extraction method is a simple and efficient method of lipin extraction，with lipin yield of（22.40±0.89）%and 85.84%long chain fatty acids（C14-C22）；In Soxhlet extraction，we get the highest yield rate of（24.37±0.21）% with Anhydrous alcohol as an extraction solvent，and we get up to10 kinds of fatty acids with petroleum ether as an extraction solvent.

chlorella；oil extracted；gas chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.006

2012-09-14

“十二五”支撑计划（2011BAD14B01）

刘宪夫（1987—），男（汉），硕士生，主要从事微藻生物能源方面的而研究。

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