宋江伟，田 宏，吴锦艳，陈 妍，尚佑军，刘湘涛

（中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的急性、热性、高度接触性传染病，是严重危害全球养猪业的重要传染病［1］。猪瘟病毒为单股正链RNA病毒，基因组编码一个由3 898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，在细胞和病毒的蛋白酶作用下加工产生12个蛋白终产物，即Npro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。其中，NS3为2 049个碱基编码的683个氨基酸残基组成的非结构蛋白。NS3蛋白是一个多功能酶蛋白，具有丝氨酸蛋白酶（serine protease）活性、核苷三磷酸酶（triphosphatase，NTPase）活性和RNA激活的解旋酶（RNA helicase）活性［2-3］，丝氨酸蛋白酶负责加工病毒多聚蛋白使之产生成熟的病毒蛋白，核苷三磷酸酶和解旋酶与病毒的复制相关［4-5］。此外，NS3蛋白在病毒与宿主细胞的相互作用中也扮演了一个十分重要的角色［6］。Qi F等［7］认为 NS3蛋白直接或间接地作用于一些重要的蛋白质，造成宿主或体外培养细胞损伤，并且NS3蛋白在猪瘟病毒的感染过程发挥着极为重要的作用，直接参与病毒损伤细胞的过程。

本研究以猪瘟病毒NS3蛋白为研究对象，将其与酵母表达载体pGBKT7重组在一起构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NS3，对构建的诱铒载体进行pGBKT7-NS3毒性和自激活性的检测，以期为从细胞cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 猪瘟病毒石门株的血液样品，由国家口蹄疫参考实验室保存；Trizol为invitrogen公司产品；PrimeScript One-Step RNA PCR Kit、各种内切酶、T4DNA连接酶、DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、YPDA培养基、SD各种缺陷性培养基、酵母菌株 Y2HGold、X-α-gal、Aureobasidin A、酵母转化试剂盒、c-Myc抗体为Clontech公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。

1.1.2 引物合成和设计 根据GenBank上猪瘟病毒石门株（登录号：AF092448.2）序列，使用DNA Star软件设计扩增NS3基因片段的引物，并在上、下游引物5′端设计NdeⅠ，SalⅠ酶切位点（下划线处），预计扩增产物长度为2 049bp。上游引物P1：5′-CATATGGGGCCTGCCGTTTGCAA-3′下游引物P2：5′-GTCGACTAGACCAACTACTTGTTTTAGTGCT-3′。引物合成及序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 猪瘟病毒NS3基因片段的扩增 取400μL猪瘟病毒石门株血毒，采用Trizol法提取总RNA。50μL RT-PCR反应体系：10×One-step RNA PCR buffer 5μL，MgCl210μL，d NTP Mixture 5μL，RNase inhibitor 1μL，AMV RTase XL 1μL，AMV-optimited Taq 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，RNA模版3μL，RNase free water 22μL。One-step RT-PCR反应条件：50℃30min；94℃3min，94℃50s；55℃ 1min；72 ℃ 90s，30个循环；72℃10min。

1.2.2 诱饵质粒pGBKT7-NS3的构建与鉴定 使用NdeⅠ和SalⅠ双酶切RT-PCR回收产物和诱饵载体pGBKT7，回收纯化后使用T4DNA连接酶将酶切后的NS3与pGBKT7 4℃过夜连接。连接产物转化DH 5α感受态细胞中，涂布于 Kan（50μg/mL）抗性LB固体平板上培养直到有菌落出现，再挑单菌落接到Kan抗性的LB液体培养基中，摇床上37℃过夜培养，提质粒做双酶切鉴定并将阳性质粒送测序验证。

1.2.3 制备酵母感受态细胞，诱饵载体转化感受态细胞 酵母感受态细胞用醋酸锂转化法制备，将冻存的Y2HGold划线接种至YPDA平板，倒置30℃培养3d，挑取一单菌落于3mL YPDA培养基中，30℃、250r/min振摇8h～12h，取5μL接种于50mL YPDA培养基中，30℃、250r/min振摇16h～20h，当OD 600nm＝0.15～0.3，室温下，700g离心5min弃上清，沉淀重悬于100mL YPDA中，30℃孵化3h～5h直到OD 600nm＝0.4～0.5，把培养基分到2个50mL锥形管中，室温下700r/min离心5min弃上清，沉淀重悬于30mL去离子水中，再室温下700g离心5min弃上清，沉淀重悬于1.5mL TE/LiAc中，转移细胞悬浮液到2个1.5mL离心管中高速离心15s，弃上清，用600μL 1.1×TE/LiAc重悬细胞。制备的感受态细胞立即使用。

在预冷的无菌1.5mL离心管中加入pGBKT7-NS3质粒100ng，变性的Yeastmaker Carrier DNA 5μL、酵母感受态细胞50μL，轻轻混匀后加入500μL PEG/LiAc，30℃培养30min，每10min轻轻涡旋振荡，加入20μL DMSO混匀后放入水浴15min，每10min轻轻涡旋振荡1次，高速离心15s后弃上清，重悬于1mL YPD plus Medium，高速离心15s后移去上清，用1mL 9g/L NaCl重悬感受态细胞，将菌液分别按1∶10和1∶100稀释后铺于SD/-Trp营养选择性培养基，30℃倒置培养3d～5d。

1.2.4 Western blot验证诱饵载体在酵母中的表达 参照酵母蛋白提取手册（Yeast Protocol Handbook，Clontech）提取诱饵蛋白，进行SDS-PAGE，转膜，BSA常温封闭4h，加入一抗c-Myc常温孵育4h，洗涤后再加入二抗常温孵育2h，之后再用DAB显色。

1.2.5 诱饵载体pGBKT7-NS3毒性和自激活性的检测 将100ng的pGBKT7空载体和诱饵载体pGBKT7-NS3分别转化酵母Y2HGold感受态细胞中，分别平铺100μL、1/10、1/100稀释度转化pGBKT7空载体和诱饵载体pGBKT7-NS3的酵母细胞到SD/-Trp平板上。再平铺100μL、1/10、1/100稀释度转化诱饵载体的酵母细胞混合物到SD/-Trp、SD/-Trp/x-α-gal和SD/-Trp/x-α-gal/AbA 平板上，转化pGBKT7-53和pGADT7-T到酵母感受态细胞后平铺到SD/-Leu/-Trp/x-α-gal/AbA 平板上，30℃倒置培养3d后观察比较菌落生长状况。

2 结果

2.1 猪瘟病毒NS3基因片段的RT-PCR扩增

PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测得到一条清晰特异性条带，大小约2 049bp，与预期片段大小一致（图1），说明从血液中成功扩增到猪瘟病毒NS3基因片段。

图1 猪瘟病毒NS3的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of CSFV-NS3gene

2.2 诱饵载体pGBKT7-NS3的双酶切分析

重组质粒用NdeⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切后电泳分析，得到约7 300bp和2 049bp大小片段，与预期结果一致。测序结果证明NS3基因插入的位置、方向、大小和读码框均正确。可用于后续试验（图2）。

2.3 诱饵载体pGBKT7-NS3的表达鉴定

提取pGBKT7-NS3的酵母菌蛋白，经Western blot分析，可见融合蛋白表达，融合蛋白分子大小约为80ku，与预期结果一致，说明该诱饵载体可用于酵母双杂交筛选与NS3相互作用的蛋白（图3）。

2.4 诱饵载体pGBKT7-NS3的毒性和自激活性检测分析

将pGBKT7空载体和诱饵载体pGBKT7-NS3分别转化酵母Y2HGold感受态细胞，分别平铺100μL、1/10、1/100稀释度转化的酵母细胞到SD/-Trp平板上，30℃倒置培养3d后，含有空载体和诱饵载体的菌落大小，颜色和克隆数基本一致，说明诱饵载体pGBKT7-NS3对酵母Y2HGold感受态细胞没有毒性。转化诱饵载体pGBKT7-NS3的Y2H酵母菌在SD/-Trp培养板上为白色菌落，在SD/-Trp/x-α-Gal培养板上为白色菌落，在SD/-Trp/xα-Gal/AbA培养板上无菌落生长，含有2个pGBKT7-53和pGADT7-T质粒的阳性对照在SD/-Leu/-Trp/x-α-gal/AbA平板上为蓝色菌落，由此证明诱饵质粒无自我激活能力，可用于酵母双杂交筛选与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的蛋白（表1）。

图2 诱饵载体pGBKT7-NS3的双酶切鉴定Fig.2 Identification of bait vector pGBKT7-NS3by double restriction endonuclease digestion

图3 转化pGBKT7-NS3后Y2HGold酵母中蛋白Western blot结果Fig.3 Expression of pGBKT7-NS3in Y2HGold yeast cells detected by Western blot

表1 诱饵载体对报告基因的毒性和自激活性检测Table 1 Toxic effect and self-activation test of bait vector pGBKT7-NS3to the reporter gene

3 讨论

NS3蛋白与猪瘟病毒体外致细胞病变有关［8］，通过对NS3蛋白与细胞病变关系的研究，将有助于分析猪瘟病毒致病机理和持续性感染形成机制。

研究表明，NS3蛋白与猪瘟病毒同一个科的C型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）与诱导宿主细胞凋亡有关。Prikhod Ko等将Vero细胞和HepG2细胞转染表达NS3蛋白的质粒48h后，Vero细胞和HepG2细胞均发生凋亡。并证实NS3蛋白是通过与caspase-8死亡效应结构域结合而诱导细胞凋亡的，但NS3蛋白不能与其他带有DED的凋亡蛋白如FADD结合。Borowski等认为HCV感染细胞的致病机制可能与NS3蛋白对宿主细胞内AMP依赖性信号途径的影响有关，因为HCV NS3蛋白中含有一段富含精氨酸的序列，该序列和蛋白激酶A（protein kinase，PKA）的热稳定抑制剂的抑制位点、PKAⅡ型调节亚基的自我磷酸化位点以及PKA底物的磷酸受体氨基酸周围的保守序列极为相似。因此，NS3蛋白在体外能够抑制蛋白激酶A的活性。Borowski等进一步证实，细胞中HCV NS3蛋白能与蛋白激酶A催化亚基特异性相互作用，从而抑制由AMP依赖性PKA介导的蛋白磷酸化。因此，HCV感染细胞中的NS3可能通过抑制PKA的一系列过程而有助于HCV严重影响细胞正常功能。

酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）是由Fields和Song在1989年利用酿酒酵母转录激活因子GAL4蛋白的特性建立的，可以识别和分析相互作用的蛋白［9］，已经用于猪瘟病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的研究［10-13］。为筛选与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主蛋白，本试验构建了用于酵母双杂交筛选的NS3蛋白诱饵载体pGBKT7-NS3，经双酶切，测序和序列比对，证实了目的片段插入正确。筛选与宿主细胞互作蛋白前首先要进行诱饵载体在酵母细胞中的毒性和自激活性检测。转化诱饵载体pGBKT7-NS3和空载体pGBKT7后的酵母菌在SD/-Trp平板上生长的菌落大小，颜色，克隆数基本一致，说明诱饵载体pGBKT7-NS3对酵母菌没有毒性。转化诱饵载体pGBKT7-NS3的酵母细胞在SD/-Trp培养板上为白色菌落，在SD/-Trp/x-α-Gal培养板上为白色菌落，在SD/-Trp/xα-Gal/AbA培养板上无菌落生长，说明构建的诱饵载体对报告基因没有自激活作用。本研究构建的诱饵载体pGBKT7-NS3符合筛选酵母双杂交细胞cDNA文库的需要，为以后筛选与NS3蛋白相互作用的蛋白研究奠定了基础。

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