戴梦源，陈 晨(综述)，陶泽璋(审校)

(武汉大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科，武汉 430060)

近年来，干细胞的研究加深了人们对肿瘤发生、发展的认识，很多肿瘤的发生都与干细胞相关。干细胞标志物成为目前研究的热点，研究证实Lgr5在人体小肠底部隐窝基底柱状细胞、结肠隐窝、胃腺体底部及毛囊中均有不同程度的表达,其可作为多种人体组织干细胞的标志物。此外，研究证明Lgr5与肿瘤的发生和发展密切相关[1]。

1 Lgr5的结构特点

Lgr5,即富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5)，又名GPR49、HG38、FEX、GPR67和MGC117008，是G蛋白偶联受体家族的成员之一[1]。Lgr5多肽链的外功能区有17个富含亮氨酸的重复序列，N端和C端尾部侧翼富含半胱氨酸序列以及高度保守的7次α螺旋跨膜区[2]。

Lgr5广泛分布于人体组织中，在大脑、脊髓、毛囊、乳腺、眼睛、胃肠道及生殖器官等均有表达[1-2]。目前发现家族蛋白R-spondins(RSPOs)为孤受体Lgr4、Lgr5的生理性配体，结合后可强化Wnt/β联蛋白信号通路，在胚胎发育和成体干细胞自我更新及维持中起着重要作用[3]。研究表明，Lgr5是多种组织成体干细胞的标志物，并与肿瘤的形成密切相关[4]。

2 Lgr5是成体干细胞的新标志物

2.1Lgr5作为小肠干细胞标志物 小肠干细胞通过隐窝分裂的方式来实现增殖。Gregorieff等[5]的研究表明，鼠类小肠不断自我更新的上皮组成了隐窝及小肠绒毛。肠隐窝是单克隆的，每一隐窝都起源于各自的肠干细胞。干细胞通过不对称分裂有规律地产生短暂增殖细胞，从而分化为各个类型的小肠上皮细胞。在过去十年中，许多小肠干细胞标志物被相继提出，Lgr5是最新研究的小肠干细胞标志物[6]。

Wnt信号通路对调节成人肠道上皮细胞动态平衡有关键作用。Barker等[7]设想一些Wnt/β联蛋白的目标基因也许特异性的表达于干细胞上，研究发现Lgr5在小肠隐窝基底柱状细胞(crypt base columnar cell，CBC)过度表达，体外培养进一步发现Lgr5+CBC能形成人类所有类型的肠上皮细胞，表明Lgr5可能是小肠干细胞的特异性分子标志物。Yui等[8]在体外实验中发现，单个Lgr5+干细胞来源的类器官移植物可在小鼠体内形成功能和组织学正常的自我更新的隐窝，并观察到移植物在体外大量扩增。Lgr5+CBC具有自我更新特性，是小肠的干细胞[9]。

小肠隐窝基底切片显示，Lgr5+CBC和终末分化的旁氏细胞有显著的对称性[5]。形态学上，Lgr5+CBC的特点是稀少的细胞质和楔形的核，均朝向隐窝腔，很容易与毗邻的旁氏细胞相区别[10]。Sato等[11]研究发现，旁氏细胞表达表皮生长因子、肿瘤坏死因子α、Wnt3以及Notch配体CD114等干细胞生长所必需的信号。干细胞和旁氏细胞共同培养显著地促进了结肠类器官的形成。在体内，随着旁氏细胞的凋亡，Lgr5+干细胞的数量出现了大幅度降低。目前研究发现，在小肠上皮中旁氏细胞是Lgr5+干细胞壁龛的关键组成部分[11]。

2.2Lgr5+细胞与结肠干细胞 结肠干细胞位于结肠黏膜的隐窝基底部，其功能为维持结肠黏膜上皮的正常再生。以往的研究表明，CD133是结肠干细胞的标志物[12]。Barker等[7]的研究发现，Lgr5+细胞局限性表达于结肠隐窝底部，可自我更新并分化成为黏膜所有的细胞类型。通过长期跟踪观察LacZ转基因小鼠发现，上皮所有细胞类型均表达在Lgr5+细胞组成的绿色克隆区，这一区域的细胞具有多潜能性，由此推测Lgr5+细胞代表了结肠上皮的永久干细胞；此实验还发现，标记的结肠隐窝干细胞几乎都局限性表达于基底部，由此推测小肠干细胞比结肠干细胞活跃[13]。

2.3Lgr5+细胞与毛囊干细胞 基因微阵列分析显示，Lgr5 mRNA高度表达于毛囊上段的隆突区，即皮脂腺开口处和立毛肌附着处的毛囊外根鞘，与毛囊生长密切相关[14]。Vander Flier等[15]发现，从毛囊隆突区分离得到的表达Lgr5的细胞是一种活跃增殖并且具有多分化潜能的干细胞群，可在移植后形成毛囊、皮脂腺和表皮。Barker等[7]通过谱系追踪试验也证实了Lgr5+细胞代表了毛囊的长期干细胞，在毛发周期过程中对毛发的循环再生起着重要的作用。Lgr5是周期性、长期存在的毛囊干细胞标志物。

2.4Lgr5+细胞与胃干细胞 胃干细胞主要位于峡部及腺体基部与上皮表面之间，但是目前还未发现明确的干细胞标志物。Gregorieff等[5]在幽门腺体基底部发现了可自我更新并多向分化的增殖Lgr5+细胞，谱系追踪表明整个腺体来源于Lgr5+细胞。

2.5Lgr5+细胞与乳腺干细胞 目前还未发现乳腺干细胞确切的标志物。Ginestier等[16]发现，乳腺干细胞定位于末端导管小叶单位；Sleeman等[17]的研究则显示干细胞位于基底上皮层；Gregorieff等[5]的研究发现Lgr5表达于乳腺基底上皮层。Lgr5能否作为乳腺干细胞标志物还需进一步研究来证实。

小肠、结肠和胃起源于内胚层，皮肤、乳腺起源于外胚层，由此可见Lgr5是横跨胚层的干细胞标志物，也许能代表成体干细胞的普遍标志物。

3 Lgr5在肿瘤组织中的表达

目前研究发现,Lgr5在正常人体组织中的表达呈局限性,而在胃肠道、卵巢、肝脏及基底细胞癌等肿瘤组织中,Lgr5的表达均有不同程度的升高[5]。

3.1Lgr5在胃肠道肿瘤中的表达 Becker等[18]采用免疫染色法比较胃肠道正常组织和癌前病变组织发现，在癌前病变组织中Lgr5的表达水平显著高于正常组织，且在正常胃肠组织中Lgr5的表达局限于隐窝基底部，而在癌前病变组织中Lgr5表达并不仅局限于隐窝基底部。由此可知，Lgr5离开隐窝基底部是肿瘤形成和恶化的早期事件，Lgr5对肿瘤的发生可能有重要作用。与之相似，结肠肿瘤的免疫组织化学结果显示,Lgr5在正常结肠组织中呈阴性或弱阳性表达，而在结肠肿瘤中则呈现强阳性表达,高水平的Lgr5表达可能与胃肠道肿瘤的形成密切相关[19]。

3.2Lgr5在肝癌中的表达 Lgr5在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织中的表达水平显著上调。Yamamoto等[19]通过反转录聚合酶连反应发现，Lgr5 mRNA在HCC组织中的表达显著高于非肝癌组织，在含有β联蛋白外显子3突变的HCC中，Lgr5基因过表达率达到了87.5%；把突变的β联蛋白导入小鼠肝细胞中也可引起小鼠Lgr5表达上调。由此推测，在肝癌中Lgr5很可能是被Wnt信号途径激活的目标基因，Lgr5可能与肝癌的形成和发展有一定联系。

3.3Lgr5在基底细胞癌中的表达 Tanese等[20]采用DNA微阵列分析人类基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)病例，发现Lgr5在所有基底细胞癌病例中的表达均显著上调；反转录聚合酶链反应发现，与对照组相比，BCC病例中Lgr5 mRNA表达上调率为95%(19/20)；敲除小鼠BCC细胞株的Lgr5基因，则可显著抑制BCC细胞的增殖。人类永生角质HaCaT细胞中Lgr5过表达可诱导细胞增殖，而把Lgr5过表达的HaCaT细胞移植到免疫缺陷小鼠则可诱发肿瘤形成。Lgr5基因可导致细胞的快速增殖，与肿瘤组织的形成有着十分紧密的联系。

3.4Lgr5在食管病变中的表达 Becker等[7]对食管样本的研究发现，Lgr5在Barrett食管中表达率增加(70%)，在高级不典型增生和食管腺癌中的表达率几乎达到100%。实验还发现，Lgr5的高表达率与食管腺癌不良预后独立相关,提示Lgr5有作为Barrett食管、不典型增生和食管腺癌生物学标记的潜能，是癌前病变及肿瘤的潜在生物学标志物。

3.5Lgr5在其他肿瘤中的表达 Nakata等[21]研究表明，脑胶质细胞瘤中Lgr5转录水平增高，其利用免疫荧光染色确定了CD133-和Lgr5+细胞在胶质母细胞瘤中的共同定位。在功能上，由慢病毒介导的Lgr5基因敲除诱导了脑胶质细胞瘤成体干细胞的凋亡。Lgr5的消耗还导致了L1细胞黏附分子的表达下调。此外，在脑胶质瘤的发生中，Lgr5的表达增加与胶质瘤的进展及不良预后相关。

Swetlana等[22]检测77例软组织肉瘤患者组织切片中野生型Lgr5和GPR49Δ5(缺少外显子5的Lgr5剪接变异体)的mRNA水平，发现GPR49Δ5mRNA低表达与软组织肉瘤的不良预后和短期无复生存率显著相关，同时，GPR49Δ5mRNA低表达的患者比高表达的患者平均发病年龄晚7.5年，显示了GPR49Δ5表达在软组织肉瘤的发生和进展中的作用。

4 小结与展望

Lgr5广泛分布于多种人体组织，在多种肿瘤中表达增加，提示它有着重要的生物学功能和临床应用前景。目前，关于Lgr5在不同信号途径中发挥作用的机制以及Lgr5细胞是否代表了肿瘤干细胞等问题，还有待进一步的研究来证实。因Lgr5在肿瘤发生中的作用，有望成为肿瘤治疗的新靶点。对Lgr5的研究提升了对干细胞生物学的理解，对鉴定和分离成体干细胞群、开发其临床药用潜能也有着很大作用。随着对干细胞研究的不断深入，有望在未来能利用这些潜在的人类干细胞群为胃肠、皮肤等疾病的治疗提供新的手段。

[1] McDonald T,Wang R,Bailey W,etal.Identification and cloning of an orphan G protein-coupled receptor of the glycoprotein hormone receptor subfamily[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,247(2):266-270.

[2] Hsu SY,Liang SG,Hsueh AJ,etal.Characterization of two LGR genes homologous to gonadotropin and thyrotropin receptors with extracellular leucine-rich repeats and a G protein-coupled,seven-transmembrane region[J].Mol Endocrinol,1998,12(12):1830-1845.

[3] Carmon KS,Gong X,Lin Q,etal.R-spondins function as ligands of the orphan receptors LGR4 and LGR5 to regulate Wnt/beta-catenin signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(28):11452-11457.

[4] Maris JM,Hogarty MD,Bagatell R,etal.Neuroblastoma[J].Lancet,2007,369(9579):2106-2120.

[5] Gregorieff A,Clevers H.Wnt signaling in the intestinal epithelium:from endoderm to cancer[J].Genes Dev,2005,19(8):877-890.

[6] Barker N,Bartfeld S,Clevers H.Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs[J].Cell Stem Cell,2010,7(6):656-670.

[7] Barker N,Van Es JH,Jaks V,etal.Very long-term self-renewal of small intestine,colon,and hair follicles from cycling Lgr5+ve stem cells[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2008,73:351-356.

[8] Yui S,Nakamura T,Sato T,etal.Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+stem cell[J].Nat Med,2012,18(4):618-623.

[9] Barker N,van Es JH,Kuipers J,etal.Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5[J].Nature,2007,449(7165):1003-1007.

[10] Snippert HJ,van der Flier LG,Sato T,etal.Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells[J].Cell,2010,143 (1):134-144.

[11] Sato T,van Es JH,Snippert HJ,etal.Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts[J].Nature,2011,469(7330):415-418.

[12] O′Brien CA,Pollett A,Gallinger S,etal.A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J].Nature,2007,445(7123):106-110.

[13] Merlos-Suárez A,Barriga FM,Jung P,etal.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse[J].Cell Stem Cell,2011,8(5):511-524.

[14] Fuchs E.The tortoise and the hair:slow-cycling cells in the stem cell race[J].Cell,2009,137(5):811-819.

[15] Vander Flier LG,Sabates-Bellver J,Oving I,etal.The intestinal Wnt/TCF signature[J].Gastroenterology,2007,132(2):628-632.

[16] Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,etal.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammnary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell,2007,1(5):555-567.

[17] Sleeman KE,Kendrick H,Robertson D,etal.Dissociation of estrogen receptor expression and in vivo stem cell activity in the mammary gland[J].J Cell Biol,2007,176(1):19-26.

[18] Becker L,Huang Q,Mashimo H.Immunostaining of Lgr5,an intestinal stem cell marker,in normal and premali gnant human gastrointestinal tissue[J].ScientificWorld Journal,2008,8:1168-1176.

[19] Yamamoto Y,Sakamoto M,Fujii G,etal.Overexpression of orphan G-protein-coupled receptor,Gpr49,in human hepatocellular carcinomas with beta-catenin mutations[J].Hepatology,2003,37(3):528-533.

[20] Tanese K,Fukuma M,Yamada T,etal.G-protein-coupled receptor GPR49 is up-regulated in basal cell carcinoma and promotes cell pmliferation and tumor formation[J].Am J Pathoi,2008,173(3):835-843.

[21] Nakata S,Campos B,Bageritz J,etal.LGR5 is a Marker of poor prognosis in glioblastoma and is required for survival of brain cancer stem-like cells[J].Brain Pathol,2013,23(1):60-72.

[22] Swetlana R,Taubert H,Bache M,etal.A novel splice variant of the stem cell marker LGR5/GPR49 is correlated with the risk of tumor-related death in soft-tissue sarcoma patients[J].BMC Cancer,2011,11:429.