唐 力，蒲德岚，夏静芬，汪财生

（浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100）

高效液相色谱法测定淡水贝类中8种邻苯二甲酸酯

唐 力，蒲德岚，夏静芬，汪财生

（浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波315100）

建立了高效液相色谱法同时测定淡水贝类中8种邻苯二甲酸酯类的方法。样品以正己烷与二氯甲烷（1∶1）为提取剂，以Agela venusil XBP-C18为分离柱，柱温25℃，甲醇-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，紫外检测波长230nm，8种PAEs得到较好分离。在0.5～50μg/mL范围内，线性良好，检测限在0.2～0.5μg/mL之间，该方法加标回收率在91.06%～107.23%之间，相对标准偏差在0.34%～3.67%之间。方法适用于淡水贝类中邻苯二甲酸酯的检测。

邻苯二甲酸酯，高效液相色谱，贝类

邻苯二甲酸酯（PAEs），是环境激素类的一种，作为聚氯乙烯、纤维素树脂、天然橡胶和合成橡胶的增塑剂广泛应用于塑料工业中，具有致畸、致突变、致癌以及生殖毒性[1-3]。邻苯二甲酸酯与塑料分子之间并不是以化学键结合，而是由氢键或范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因此它极易从塑料中释放，从而转入空气、水体、底质和生物等环境载体中，通过食物链危害着人体健康[4-5]。

邻苯二甲酸酯类对水体的污染在国内已有许多报道，其主要来源于生产和使用邻苯二甲酸酯类的工厂所排放的工业污水[6-7]。贝类属于滤食性生物，移动性相对较差，生活地域极为固定，所处环境受污染后，难免在滤食饵料时从水中吸入各种有害化学物质，PAEs等有机污染物具有较强的亲脂性，使其能在贝类中进行生物累积，并最终经食物链传递危害人类健康[8-9]。因此，建立一种高效、简便、准确的方法来检测贝类肉中的邻苯二甲酸酯类，对于开展贝类生物体中PAEs安全评估具有重要的指导意义。

目前，国内外PAEs的分析方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法及色谱-质谱联用法，分析的样品以环境、食品、塑料样品为主[10-12]，尚未见对淡水贝类的研究报道。本文选择了水体中常见的8种PAEs为研究对象，包括美国国家环保局列入优先控制污染物的DMP、DEP、DBP、BBP、DOP、DEHP[13]，以及较受关注DPP与DIPP，建立了高效液相色谱法同时测定淡水贝类中8种邻苯二甲酸酯的方法，该方法简便、快速，重现性好，准确度高，为淡水贝类中邻苯二甲酸酯类物质准确的分析提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8种PAEs标准品（DMP、DEP、DPP、DBP、DIPP、BBP、DOP、DEHP） 纯度均大于99.5%，上海国药集团化学试剂有限公司；甲醇、水 色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司；正己烷、二氯甲烷 分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；淡水贝类样品（螺蛳、黄蚬和田螺） 宁波市各大超市或菜市场。

Agilent 1100型高效液相色谱 美国安捷伦公司；BS224S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；SK8200H型超声波清洗仪 上海科导超声仪器有限公司；DS200型高速度组织捣碎机 江苏江阴周庄红旗冲件厂；DK-8D型三孔电热恒温水槽 上海奇欣科学仪器有限公司；Neofuge型台式高速冷冻离心机 力康发展有限公司；RE-2000B型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理 将购置的新鲜贝类置于烧杯中，70℃水浴加热30min，将贝类除壳以外所有贝肉全部取出，加入适量的生理盐水后，使用高速组织捣碎机，以10000r/m in处理5m in，然后移入50m L的离心管中，于4℃，15000r/m in条件下离心15m in。弃去上清液，将下层固体移入小烧杯中待用。

称取贝肉5g，置于50m L离心管中，加入25m L 1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液，500W，53Hz超声提取30min后，在4℃下以15000r/min转速离心10min，移取上清液至旋转蒸发仪上浓缩，浓缩液移入2m L试管中，用甲醇定容到2m L，保存备用。测定时，提取液需经聚苯乙烯柱净化和0.45μm有机滤膜过滤后供HPLC测定，每个样品平行测定三次。

1.2.2 标准溶液配制 以甲醇为溶剂，配制浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、25、50μg/m L的PAEs混合标准工作液。绘制标准曲线，用外标法计算样品中PAEs的含量。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agela venusil XBP-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测器为紫外检测器，检测波长230nm；流速1.0m L/m in；柱温：25℃；进样体积：1μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradientelution program

2 结果与讨论

2.1 条件优化实验

2.1.1 样品处理条件选择 邻苯二甲酸酯是亲脂性有机化合物，易溶于大多数有机溶剂。本实验考察了正己烷、二氯甲烷、乙腈以及混合液的提取效果，不同溶剂的提取效果见表2所示，结果表明单一溶剂提取的PAEs种类偏少，提取效果较差，而采用混合溶剂提取时，效果明显优于单一溶剂，因此实验选用1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液作为提取液。

改变超声萃取时间，考察邻苯二甲酸酯类提取效果，选择超声时间分别为10、20、30、40m in。结果发现，随超声时间的增加，提取组分的种类和提取量也逐渐增加，并在30m in达到最大值，超声时间进一步增加，提取的PAEs种类和提取量并无显著变化，结果见表3，因此，超声提取邻苯二甲酸酯类的时间控制在30min为宜。

表2 不同溶剂对邻苯二甲酸酯提取效果的影响（mg/kg）Table 2 Effectof different extraction solvents on extraction of phthalic acid esters（mg/kg）

表3 超声时间对邻苯二甲酸酯提取效果的影响（mg/kg）Table 3 Effectof ultrasonic time on extraction of phthalic acid esters（mg/kg）

2.1.2 色谱条件的选择 PAEs在紫外检测区230、254、275nm均有不同程度的吸收峰，结果显示在波长230nm下邻苯二甲酸酯类的吸收强度明显高于其他两波长，结果见图1所示，因此选择230nm作为检测波长。

图1 不同波长下PAEs样品色谱图Fig.1 The chromatogram of PAEs standards at differentwavelengths

采用HPLC测定PAEs时，流动相常选用水-甲醇体系，本实验以水-甲醇（25∶75）为流动相进行洗脱时，PAEs各色谱峰都具有一定的分离度，但DSP与DPP、BBP与DBP、DEHP与DOP三组由于结构相似或存在同分异构体关系或相对分子质量接近，R＜1.5，因此考虑以水-甲醇作为基础流动相探索梯度洗脱条件。在如表1所示的条件下，8种PAEs完全分离，出峰时间在21m in以内。

2.2 标准样品的色谱分析

本实验采用保留时间定性，峰面积外标法定量分析。标准样品色谱分离情况如图2所示。

图2 8种PAEs标准样品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 8 PAEs standards

在1.2.3设定的色谱条件下，将配制好的PAEs混合标准工作液进样分析，以色谱峰面积（y）对相应质量浓度（x）绘制标准曲线，以3倍信噪比计算8种PAEs的检测限，结果见表4。

表4 8种PAEs标准样品的回归方程、相关系数、线性范围及检测限Table 4 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limits of 8 PAEs standards

2.3 回收率和精密度

实验以螺蛳肉为样品，测定PAEs的回收率，取5g螺蛳肉，分别加入浓度为5.00、20.00、40.00μg/m L的邻苯二甲酸酯混合标准溶液5m L，每个添加量平行测定5次，计算回收率和精密度，结果见表5。8种PAEs三个水平的回收率在91.06%～107.23%，相对标准偏差为0.34%～3.67%，表明该方法具有较好的回收率与精密度。

表5 8种PAEs的回收率及相对标准偏差Table 5 Recoveries and RSDs of 8 PAEs

2.4 实际样品分析

采用本文建立的方法，对购买的三种淡水贝类（螺蛳、黄蚬和田螺）进行测定，样品均能检测出一定量的PAEs，检测结果见表6，图3为螺蛳实际样品的色谱图。

表6 三种贝类中PAEs的检测结果（mg/kg）Table 6 The detection results of 8 PAEs in 3 kinds of shellfish（mg/kg）

3 结论

本文以正己烷和二氯甲烷为提取剂，液液萃取贝类中的8种PAEs，以甲醇-水为流动相采用高效液相色谱法建立了淡水贝类中邻苯二甲酸脂类化合物的检测方法。方法操作简便，回收率高，重现性好。在实际样品分析中，螺蛳、黄蚬和田螺中8种PAEs均有检出。

图3 实际样品色谱图Fig.3 Chromatogram of real samples

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Determ ination of eight phthalic acid esters in freshwater shellfish by high performance liquid chromatography

TANG Li，PU De-lan，XIA Jing-fen，WANG Cai-sheng
（School of Biological and Environmental Sciences，ZhejiangWanliUniversity，Ningbo 315100，China）

The method for the quantitative analysis of eight phthalic acid esters in freshwater shellfish was estab lished by high performance liquid chromatog raphy.The sam p les were extracted by hexane and dichloromethane（1∶1）and separated by an Agela venusil XBP-C18column w ith the column tem perature of 25℃.The mobile phase was composed ofmethanol and water，and used w ith g rad ient elution at the flow rate of 1.0m L/m in.The UV detec tion wavelength was 230nm.The separation of eight phthalic acid esters was good. The standard curves were linear in the range from 0.5 to 50μg/m L，w ith the lim its of detec tion ranging from 0.2μg/m L to 0.5μg/m L.The additional standard recoveries of the method were in the range from 91.06%～107.23%，and the relative standard deviation from 0.34%to 3.67%.The p roposed method could be app lied to the determ ination of phthalic acid esters in shellfish.

phthalic acid esters；HPLC；shellfish

TS201.6

A

1002-0306（2014）18-0063-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.004

2013－12－31

唐力（1979－），女，硕士研究生，讲师，研究方向：色谱及光谱分析与应用。

浙江省公益性技术应用研究计划项目（2013C37074）；宁波市自然科学基金（2012A610151）。