陈文娟+谢勇平+张晓婵+赖静萍+金子越+方战强+方展强

摘 要：采用动力学酶标荧光法，检测了东莞市数所污水处理厂、制药厂和电子厂废水对食蚊鱼（Gambusia affinis）肝组织中7-ethoxyresorufin o-deethylase （EROD）酶活性的影响，评价了运用EROD酶活性监测水环境污染物的生物效应的可行性。结果显示，食蚊鱼分别暴露于经稀释为20%，40%，60%，80%不同梯度的废水液72 h后，肝脏EROD酶的活性分别与受试城市污水处理厂、制药厂和电子厂的废水之间存在剂量效应关系，EROD酶活性随污水浓度的增加而提高。电子厂废水的最大诱导倍数与对照组的比值可达到5.26，这表明其水体中存在的有机污染物较多，污水处理厂次之，制药厂的出水中污染物最少。研究表明，食蚊鱼肝组织EROD酶活性可以作为监测城市废水污染的理想生物标记物，后续的研究工作应使之标准化。

关键词：动力学酶标荧光法；城市废水；EROD酶活性；食蚊鱼

中图分类号：X703 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.013

Effects of EROD Activity in Liver of Mosquitofish Exposed to Urban Wastewater

CHEN Wen-juan1，3， XIE Yong-ping1，3， ZHANG Xiao-chan1，3， LAI Jing-ping1，3， JIN Zi-yue1，3， FANG Zhan-qiang2，3， FANG Zhan-qiang1，3

（1. College of Life Science， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510631， China； 2. School of Chemistry and Environment， South China Normal University， Guangzhou， Guangdong 510006， China；3. Guangdong Technology Research Center for Ecological Management and Remediation of Urban Water System， Guangzhou， Guangdong 510006， China）

Abstract： The kinetic enzyme assay method was used to measure the 7-ethoxyresorufin o-deethylase （EROD）activity in liver of mosquitofish （Gambusia affinis） exposed in enterprise wastewater from the number of sewage treatment plants， pharmaceutical plants and electronics factory of Dongguan City in order to assess the degree of pollution by persistent organic pollutants in water environment. Male mosquitofish were exposed to 20%， 40%， 60% and 80% of the different gradient dilution of wastewater for 72 h by using the hydrostatic bath method， and the EROD enzyme activities in fish liver were detected， respectively. The results showed that within a certain concentration of pollutant， there were dose-effect relationship between in EROD activity and wastewater pollutant concentration. In a certain range of pollutant concentrations， EROD activity with the increase of effluent， dose-response relationship evident. The largest electronics factory experimental group and control group induction ratio was 5.26， which indicated that the persistent organic pollutants in wastewater from the electronics plants were higher than that in sewage treatment plants and pharmaceutical plants. Reality monitoring practice confirmed that the use of EROD for water monitoring of the biological effects of environmental pollutants is feasible， but still need more detailed studies to supplement， improve， and standardize.

Key words： kinetic enzyme assay； urban wastewater； EROD activity； Gambusia affinis

持久性有机污染物如有机氯杀虫剂、多氯联苯（PCBs）和多环芳烃（PAHs）等，能诱导生物机体内一些酶活性的提高。污染物在生物体内进行生物转化过程阶段I和阶段II的酶，包括混合功能氧化酶系（MFO）、谷胱甘肽转移酶（GST）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UDPGT）等。其中MFOs是污染物在体内进行生物转化阶段I过程中的关键酶系[1]。MFOs系统主要分布于动物的肝、肺、皮肤、肾等器官组织中，肝脏是MFOs最活跃的部位。生物代谢中酶活性的变化是一种能反映环境物理和化学变化的生物标记物，可以对环境的变化提供早期预报，可以监测环境污染状况。7-乙氧基异吩唑酮-脱乙基酶（7-ethoxyresorufin o-deethylase，EROD）属MFOs中的P4501A族，是第1阶段代谢酶，EROD对多环芳烃（PAHs）的作用非常敏感，国外已经将此酶用于原油污染、牛皮纸厂排放液、工业废水和城市污水的环境评价中[2]。由于水环境中超痕量的有机污染物都对与其共存的鱼体内EROD的活性产生明显的诱导作用，因此，该监测指标可作为评估水环境健康状况的早期预警指标[3]。目前国内的研究主要集中于EROD与某些持久性有机污染物的浓度效应关系，如多环芳烃化合物[4]、重金属[5]、有机氯化合物[6]和二噁英类化合物[7]对鱼类微粒体EROD的体内和体外诱导作用。有研究发现EROD的活性变化与PAHs、二噁英类化合物和有机氯化合物的浓度存在一定的剂量-效应关系，其活性变化可以作为评估该类污染物的生物标志物[4，6-7]，但对如何利用生活在城市污染河涌中的食蚊鱼肝组织中的EROD酶活性，进行水环境污染物的生物效应监测尚少研究报道。

食蚊鱼（Gambusia affinis）是原产于北美洲的著名入侵种，属鳉形目（Cyprinodontiformes），胎鳉科（Poeciliidae）。在我国华南地区，食蚊鱼广泛分布在淡水水体，尤其多被发现生活于城市河涌中，容易捕捞，易于在实验室进行试验，因此被广泛用于作为生物指示种类。本研究通过室内试验与研究，分析暴露在东莞具代表性的数所城市污水处理厂、制药厂和电子厂排出的废水中生活的食蚊鱼，分别检测经不同稀释浓度污水暴露后的食蚊鱼肝脏内EROD活力，探讨该地区水环境的污染现状，为当地环保部门提供污染治理的科学依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

TV紫外分光光度计、96孔板、移液枪、离心管（1.5 mL）、蛋白质检测试剂盒、自动酶标仪等.NADPH（N-1630）7-乙氧基异吩噁唑酮（7-Ethoxyresorufin，sodium salt of resorufin；E-3763）、异吩噁唑酮（resorufin）均购自美国Sigma公司。

1.2 试验动物和暴露设计

食蚊鱼购自广州市花地湾花鸟鱼市场，对食蚊鱼进行性别鉴定：雄鱼平均体长20～35 mm，具有生殖鳍（第3鳍条明显延长），且鳍上具钩的为性成熟的雄鱼个体；具有生殖鳍，但没具钩的为未性成熟的雄鱼（幼鱼）。雌鱼体长17～60 mm，第3鳍条没有延长，无胎斑（食蚊鱼怀孕时腹部有一明显的黑点，称之为胎斑）的幼鱼，及具有胎斑的为怀妊个体，属性成熟的雌鱼。试验鱼在生命科学学院生态毒理学实验室暂养，随机性地从东莞4所城市污水处理厂、4所制药厂和3所电子厂采集废水并分别稀释为20%，40%，60%，80%等梯度浓度，再将等量健康、活力强的生长状况相近的雄性食蚊鱼（每试验组12尾）暴露于上述的污水稀释液72 h，然后分别将试验鱼处死并迅速取出肝脏样品暂贮藏冰箱。同时设置平行实验组。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备 取肝脏样品（30±1.5） mg，加1.5 mL预冷的匀浆液（磷酸缓冲液pH值 7.6）于匀浆机中匀浆2 min后进行冷冻离心（-4 ℃，10 000 r·min-1， 20 min），上清液分装3份，1份用作测定EROD，1份用作测定蛋白质，1份备用。上清液分装后，马上保存在4 ℃下，待分析测定。

1.3.2 EROD活性的测定 EROD活性测定参照Pohl and Fouts[8]方法稍作修改。对实验室测定条件进行优化：选择pH值7.6的NaH2PO4体系作为本试验的缓冲液；试验中采用0.92 μmol·L-1的底物浓度；NADPH在反应中起到还原剂和电子供体的作用，反应方程式为：RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+， 反应体系中NADPH的浓度为0.13 mmol·L-1；选择22 ℃作为试验的反应温度，并且在5 min中内完成测定，以获取活性的最大值，并在活性开始衰减前完成测定。EROD活性的测定公式：

■

1.3.3 蛋白质含量的测定 采用Bradford法[9]，取300 μL离心后的酶源上清液或其稀释液，加入96孔板的每个孔中，在A1～F1孔中加入10 μL的蛋白标准液，在A2～F2孔中加入10 μL ddH2O，在T1～T24中分别加入10 μL的样品匀浆液，每个样品设置3个重复，加入显色剂考马斯亮蓝，在黑暗下室温静置5 min，接着放入酶标仪中通过测定595 nm下的吸光值来确定蛋白质的含量。蛋白标准为小牛血清（购自上海生化试剂公司）。蛋白质含量按以下公式计算：

1.4 数据处理

采用SPSS16.0统计软件对所得数据进行统计学分析。采用单因素方差分析（One Way-ANOVA）法对数据进行差异性分析。用Excel 2003做柱形图。设置P<0.05时，表示差异显著；当P<0.01时，表示差异极其显著。

2 结果与分析

2.1 不同稀释浓度废水暴露肝脏EROD活性的变化

食蚊鱼暴露于不同稀释浓度的企业废水中72 h后其肝脏EROD活性的变化结果见表1，东莞3所电子厂的最大诱导倍数与对照组的比值达到5.26，表明其水体中存在的持久性有机污染物较多，而4所污水处理厂次之，4所制药厂的出水中污染物则最少。

可以看出，在一定浓度范围内，EROD酶的活性值与受试点稀释废水浓度之间存在着剂量效应关系。在一定的浓度范围内，EROD酶的活性随着废水浓度的升高而增加，剂量-效应关系明显。而当废水浓度升高时，EROD酶的活性则大幅下降。上述结果说明鱼体中EROD活性对水环境中特定有机污染物具有较好的指示作用。

如图1所示，本次试验随机取样的4所城市污水处理厂中，污水处理厂1、污水处理厂3和污水处理厂4出水口废水的稀释浓度在20%到40%之间，受暴露的食蚊鱼肝脏EROD酶的活性随着升高，而暴露在40%到80%的浓度时，其EROD酶的活性则逐渐降低；食蚊鱼暴露在污水处理厂2出水口废水的稀释浓度在20%到40%之间时，EROD酶的活性也随着升高，所不同的是，随着浓度的再进一步升高，EROD酶的活性则随之先下降后再上升，其最高诱导倍数是对照组的2.09倍（表1），与其他3个污水处理厂相比差异显著（P<0.05）。

如图2所示，受试的制药厂1、制药厂2、制药厂3和制药厂4等4所制药厂出水口采集的废水样品经稀释为20%，40%，60%，80%的浓度，对食蚊鱼肝脏EROD活性所测得的最高诱导倍数相对于污水处理厂的较低，分别为1.36，1.06，1.24，1.01，

基本接近对照组的水平（表1）。其中制药厂3采样点测得的食蚊鱼肝脏EROD酶的活性与对照组相比有极显著差异（P<0.01）。

如图3所示，受试的电子厂1、电子厂2和电子厂3所采集的废水样品稀释为20%，40%，60%的浓度，当食蚊鱼暴露在电子厂2和电子厂3样品40%和60%的浓度时，所测得的最高诱导倍数达到5.26和5.03之多（表1），与对照组相比均存在极显著差异（P<0.01）。

2.2 不同企业排放废水暴露肝脏EROD活性的变化

本试验比较了食蚊鱼暴露于污水处理厂、制药厂和电子厂不同企业所排出废水（同一浓度）中72 h后对其肝脏EROD活性影响的结果。

如图4所示，经电子厂废水暴露后所测得的食蚊鱼肝脏EROD活性最高，其次是污水处理厂，最低的则为制药厂。其中食蚊鱼暴露于同一浓度的电子厂废水中，测得其肝脏EROD活性相对于污水处理厂和制药厂废水的要高得多，如浓度为20%时，电子厂2和电子厂3废水所暴露的EROD活性达到0.844，0.599 pmol·（min-1·mg-1），与对照组的比值达到5.26，5.03（表1），而污水处理厂和制药厂在该浓度所测得的肝脏EROD活性最高也只达到0.417，0.237 pmol·（min-1·mg-1）。在浓度为60%时，电子厂2和电子厂3废水所暴露的EROD活性达到1.051，1.005 pmol·（min-1·mg-1），而污水处理厂和制药厂在该浓度所测得的肝脏EROD活性最高也只达到0.371和0.278 pmol·（min-1·mg-1）。

EROD酶属MFO中的PA501A族，是评价有机污染物生物毒性的敏感酶学指标。肝脏细胞色素氧化酶P450系统（CYP450）的主要作用是催化外源性化合物的代谢，增加底物的亲水性和极性，促进排泄。因此许多潜在致毒、致突变、致癌化合物（如多环芳烃PAH、多氯联苯PCB等持久性有机物）都能够诱导EROD的活性，而且其活性增加的程度与共存环境中特定污染物的浓度存在着显著的剂量-效应相应关系。本研究结果表明，电子厂废水中存在的持久性有机污染物较多，污水处理厂次之，制药厂的则最少。

3 结论与讨论

3.1 食蚊鱼暴露于同一企业的不同浓度的废水中肝脏EROD活性的变化

本试验结果显示，不同废水浓度对EROD活性的影响，大体表现为低浓度诱导，高浓度抑制。已有文献报道多环芳烃化合物可诱导EROD酶的活性，使其活性升高，且EROD活性的升高与PAHs的浓度存在剂量-效应关系[10]，如在苯并[a]芘（BaP）浓度达到0.022 μmol·L-1时酶活性达到最大，随着浓度的升高，酶的活性反而迅速下降。王菊英等[10]于2003年研究了多氯联苯PCB-28对牙鲆肝脏中EROD活性的诱导作用，发现即使是加标浓度最低的5 μg·dm-3浓度组，其EROD活性也达到了对照组的1.7倍，加标量为30 μg·dm-3时，EROD的活性比对照组高出1.5倍。徐盈等[11]在利用EROD生物测试法快速筛选采集于湖北省鸭儿湖地区环境样品二噁英类化合物的研究中发现，EROD生物测试法具有良好的剂量效应关系，适合于对环境样品中的二噁英类化合物进行快速定量筛选，而HRGC/HRMS-MID对生物测试所获得的数据也进行了进一步确认。已有报道利用淡水贻贝（Dreissena polymorpha）的EROD酶活性的升高和AChE（乙酰胆碱酯酶）酶活性的抑制作为生物标志物，调查意大利被POPs污染的sTb-alpine great lakes 的17个位点，结果发现与参照点Lake LTgano相比具有显著性升高[12]。这些研究结果与本试验结果相一致，分析所取的不同企业废水都有不同程度的污染，存在一定量的持久性有机污染物，这些有机污染物诱导了食蚊鱼肝脏中混合功能氧化酶的代谢，导致EROD的活性升高。由于EROD活性受特定污染物的诱导是相当显著的，因此可以在生物体尚未受到严重伤害或未发生生物积累时就可指示出特定污染物的存在。上述结果既体现了EROD活性对持久性有机物的指示作用，也较好地体现了EROD活性具有早期预警功能。

从食蚊鱼暴露于不同浓度的同一企业废水中后其肝脏EROD活性的变化图形来看，大多为“钟形（bell）”曲线，这种曲线在PCBs或PAHs对EROD诱导的体内、体外实验都已经有过报道。研究结果显示，开始时酶活性随着毒物的浓度升高而增大，但增大到一定程度时反随着浓度的增高而降低。这种反应是脊椎动物包括哺乳动物、鸟类、鱼类的普遍反应[13]。我们认为引起这种现象的原因可能是当受试鱼肝脏EROD酶受到污水中有机污染物诱导时，其活力迅速增加，但当接触更高浓度的刺激时EROD酶活力反而降低。随着有机污染物及其代谢产物在体内的富集，肝细胞中的酶系统因受毒性影响而失活，这也可能与脂质过氧化有关。有些有机污染物如BaP在活化代谢过程中可生成20余种代谢物，均有不同程度的脂质过氧化作用，可导致CYP1A1的组装或构型的改变，从而降低EROD酶活力水平[14]。而本试验从污水处理厂2废水得出的结果却显示，受试鱼在暴露期间其肝脏EROD的活性出现了先升高后降低再升高的变化趋势，最后再升高的原因可能是脂质过氧化产生的自由基被及时清除，没有对肝脏造成严重的损伤，另一方面也可能与食蚊鱼自身的防御系统和污水中存在的有机污染物的代谢产物有关，如BaP等持久性有机污染物进入鱼体后产生的多种代谢产物，但究竟是哪一种或是哪几种代谢产物？其主要作用是什么？这还有待进一步研究。

3.2 生物体内活性与环境中特定污染物浓度的定量响应关系

就污染物的生物效应监测技术而言，研究受试生物体内EROD活性的最终目的，是建立生物体内EROD活性与环境中特定污染物浓度的定量响应关系。但是应当指出，在自然环境中，影响生物体内EROD活性的因素是多种多样的，如环境温度、盐度，生物自身的体长、年龄和性别，是否处于排卵期，受试生物体内各组织器官对污染物的敏感程度、季节变化和时空变化，尤其是多种污染物共存时其毒性的加合、协同抑或拮抗等，都是不可预知的。因此建立生物体内EROD活性与环境中特定污染物浓度的定量响应关系难度相当大。到目前为止，只能通过具体实例来分析环境中某些特定污染物对目标生物体内EROD活性的诱导作用。在研究红鲻鱼（Limanda limanda）体内的EROD活性后发现，鱼肝内多氯联苯PCB-28的浓度与EROD活性存在着良好的正相关关系，尤其是PCB-28（R=0.991）与试验结果几乎是一致的；在农药类污染物中林丹与其具有一定的正相关性；痕量金属与EROD活性基本上不具有明显的相关性[15]。本研究结果则显示，在一定浓度范围内，EROD酶的活性值与受试工厂废水浓度之间存在剂量效应关系，EROD的活性随着污水浓度的升高而增加，剂量-效应关系明显，这表明鱼体中EROD活性对水环境中特定有机污染物具有较好的指示作用。

由于EROD活性受到诸多因素的影响，在很多的现场研究中EROD活性和化学法测定的数据也不相一致。如对英国鲑鱼的现场研究表明，CYP1A1蛋白水平和EROD活性都异常高，但与分析化学所测得的PAHs和PCBs含量的数据不相一致[16]。对暴露于地中海法国沿岸的PAHs和sea comber（Serranus cabrilla）鱼肝EROD活性分析，二者没有很好的相关性[17]。因此，很多学者认为，通过单纯地分析EROD活性来检测环境中的有机污染物是不够的。运用生物效应指标对水环境的污染状况进行评价时，若单独使用某一种生化指标很可能会导致评价结果与现场实际污染状况的偏离，但如果能在同一评价区域同时使用几种不同的生化指标，并结合生理学及化学测定数据，其评价结果可能会如实地反映现场的真实污染状况。许多现场监测实践证实：运用EROD进行水环境污染物的生物效应监测是切实可行的，但仍需进行更为详尽的研究以补充、完善，并使之标准化。鉴于此，大量的研究工作还有待于今后进行。

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