王曼茹 何泰东 刘志承

（广州中医药大学附属深圳市中医院药学部,深圳518033）

HPLC-DAD法同时测定乙肝扶正胶囊中6种有效成分的含量

王曼茹 何泰东 刘志承*

（广州中医药大学附属深圳市中医院药学部,深圳518033）

目的 建立同时测定乙肝扶正胶囊中6种有效成分含量的方法。方法 采用二极管阵列检测器（DAD）波长切换高效液相色谱法。流动相为乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液（梯度洗脱）,检测波长为320nm（0～40min）,切换为254nm（40～65min）检测5家厂乙肝扶正胶囊的有效成分。结果 没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇、肉桂醛、丹参硐ⅡA6个有效成分的色谱峰能有效分离,其质量浓度分别在0.244～4.88、0.196～3.92、0.272～5.44、0.208～4.16、0.272～5.44、0.200～4.00mg·ml-1范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r≥0.99）;其检出限分别为2.86～8.86ng·ml-1,定量限分别10.06～20.86ng·ml-1,均符合含量测定要求。5家厂的产品中的6种有效成分均能同时检出。结论 本方法快速、准确、重复性好,可用于乙肝扶正胶囊的质量控制。

乙肝扶正胶囊;二极管阵列检测器;HPLC-DAD法;有效成分;同时检测

乙肝扶正胶囊是乙型肝炎辨证肝肾两虚治疗的常用中成药,为《卫生部药品标准》[1］收载品种,长期以来其质量控制只测定其中某一中药有效成分,不够科学全面,笔者延用乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液为流动相梯度洗脱[2］,采用波长切换HPLC-DAD法同时测定乙肝扶正胶囊中的6个有效成分,并用于检测5家厂的产品质量,结果令人满意。

1 仪器与试药

HPLC1100（美国Agilent公司,包括DAD二极管陈列检测器,Agilent Chem-station色谱工作站等）,SCQ2200型超声波清洗器（上海声彦超声仪器有限公司）,SZ293型自动双重纯水蒸馏水器（上海亚荣生化仪器厂）,AB404-S型电子天平（瑞士梅特勒—托利多公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯美国迪马公司）：其他试剂均为分析纯,水为双蒸水,没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇,肉桂醛、丹参硐ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院,供含量测定用,批号分别为0831-9901、120923-200809、0844-9902、111535-200601、0773-9911、0766-200910）乙肝扶正胶囊（A.广州白云山中药厂,批号：120801;B.重庆东方药业股份有限公司,批号：120802;C.惠州九惠制药厂,批号：120903;D.广东罗浮山制药有限公司,批号：120904;E.贵州良济药业有限公司,批号：120905）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别称取已干燥恒重的对照品适量,分别以甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为没食子酸2.44mg·ml-1,虎杖苷1.96mg·ml-1,二苯乙烯苷2.72mg·ml-1,白藜芦醇2.08mg·ml-1,肉桂醛2.72mg·ml-1,丹参酮ⅡA2.00mg·ml-1的对照品溶液,再分别精密量取各单组分对照品溶液适量置于同一10ml量瓶中,加甲醇稀至刻度摇匀制成混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取乙肝扶正胶囊10粒取其内容物,研细,精密称取一粒的重量（约0.4～0.5g）,置于10ml量瓶中,加甲醇5ml超声（频率：20KHz,功率80W）60min,放冷至室温,用甲醇释至刻度摇匀,用微孔滤膜（0.45μm）滤出,备用。

2.2 色谱条件与系统适用性试验［2］色谱柱：DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm,5μm）;流动相乙腈-甲醇-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脱,检测波长为：320nm（0～40min检测没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇）;254nm（40～65min检测、肉桂醛、丹参酮ⅡA）;流速：1.0ml/min;柱温：30℃;进样量：20μl。

在上述色谱条件下,分别取混合对照品溶液,供试品溶液各20μl进样分析。结果没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇、肉桂醛、丹参酮ⅡA6个色谱峰的分离良好,与相邻色谱峰的分离度均≥1.5。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算不低于5000,见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系与检出限及定量限 精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0ml,分别置10ml量瓶中再用甲醇稀释至刻度摇匀,取20μl进样,在上述色谱条件下进行测量记录各自峰面积,以各成分质量浓度（X、mg·ml-1）为横坐标,相关的峰面积分值（y）为纵坐标,绘制各相关的标准曲线,考察线性关系。

表1 线性关系考察结果

将上述混合对照品溶液继续稀释,测定,检测6个有效成分的最低检出限和最低定量限,结果最低检出限和最低定量限没食子酸为8.86ng·ml-1和20.86ng·ml-1虎杖;苷为4.56ng·ml-1和16.76ng·ml-1;二苯乙烯苷为3.96ng·ml-1和12.67ng·ml-1;白藜芦醇为3.05ng·ml-1和11.98ng·ml-1;肉桂醛为7.68ng·ml-1和18.55ng· ml-1;丹参酮ⅡA为2.86ng·ml-1和10.06ng·ml-1。

2.3.2 含量测定方法学考察 按规定方法进行含量测定相关方法学考察,结果表明精密度试验RSD分别在1.56%～1.93%;重复性试验RSD分别在1.51%～1.88%;加样回收试验,三个水平加样平均回收率没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇、肉桂醛、丹参酮ⅡA分别为98.34%、97.70%、98.81%、99.98%、99.32%和99.34%,其RSD则分别1.62%、1.46%、1.55%、1.26%、1.36%和1.42%（n=3）,均符合含量测定的要求。

2.4 样品含量测定 分别取5家厂的乙肝扶正胶囊内容物约0.5g,精密称定按“2.1.2”项下分别制备供试品溶液,在“2.2”色谱条件进行测定,记录峰面积（n=3）取平均值,依法计算各厂家样品中6种有效成成的含量。

表2 5家厂的样品含量测定结果（n,%）

3 讨论

《卫生部药品标准》收载的乙肝扶正胶囊的检测及目前文献中的乙肝扶正胶囊一般都是采用HPLC测定其中的单一成分,只有张硕旭等[2］采用梯度洗脱法将其中6个有效成分分离测定,笔者则采用HPLC-DAD波长切换法,在0～40min, 320nm波长切换成40～65min254nm波长,亦像张硕旭一样同时分别测定其中上述6个有效成分（没食子酸、虎杖苷、二苯乙烯苷、白藜芦醇、肉桂醛、参酮ⅡA）的含量,5家厂的乙肝扶正胶囊的6种有效成分均已检出（见表2）,各厂样品的6个有效成分的总含量最高百分率为最低的2.225倍,白藜芦醇有效成分含量最高百分率为最低百分率的5.24倍。

笔者采用HPLC-DAD波长切换法先进技术,DAD二极管阵列检测器具有快速提供待测物的三维图谱,具有自动快速选择波长检测各有效成分的功能,本研究应用结果与feng[3］应用本法测定中成药益宫胶囊中的10种活性成分的效果相同,亦与曾俊芬等[4］在320nm和280nm波长处切换测定通脉口服液中5种有效成分相当,而且测定结果与张硕旭等[2］所测定结果基本一致,比凌英蓉等[5］前期所测定的方法先进科学,已由单一成分的测定提高到能同时测定其中的6种有效成分。

国内外现代研究认为,多指标定量图谱具有数据全面,图谱质优与化学计量学紧密结合等优点特征[6］,能对中药复杂系统全面反映整体质量,其在中药质量控制领域中具有良好的应用前景[7-8］。笔者建议卫生部药典委员会能尽量采用现代先进科学技术,改善乙肝扶正胶囊只测定其单一成分（或少数成分）的质监方法,以改进和完善卫生部药品标准。

[1］中华人民共和国卫生部药典委员会·中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第一册）[S］.1989：1.

[2］张硕旭,孙冬晓,董立华,等.HPLC法同时测定乙肝扶正胶囊中6种化学成分的含量[J］.中国药房,2012,23（27）：2546-2549.

[3］Feng C Cai YL.Ruan ZL.Simultaneous determination of active components in traditional Chinese medicine“YIGONG”capsule by RP-HPLC-DAD[J］.Pharm Birned Anal,2008,47（2）：442.

[4］曾俊芬,宋金春,鲁建武,等.HPLC同时测定通脉口服液中5种有效成分的含量[J］.中国药学杂志,2010,45（6）：461.

[5］凌英蓉,郭斌.不同厂家乙肝扶正胶囊的产品质量研究[J］.中国医药导报, 2009,4（6）：53.

[6］雷利利,张熙洁,侯林中,等.现代色谱技术在中药制剂多指标成分质量控制中的应用[J］.中国药房,2011,22（39）：3733-3735.

[7］Liang XM.Jin Y.Wang YP.et al.Qualitative and guantitative analysis in guality control of traditional Chinese medicine[J］.J chromatogr A.2009,1216（11）：2033.

[8］Ganzera M.Recent advancement and applications in the analysis of traditional Chinese medicines[J］.Planta Med,2009,75（7）：776.

Simultaneous Determination of 6 Active Ingredients in Yigan Fuzheng Capsules by HPLC-DAD

Wang Manru He Taidong Liu Zhichen✫
(Depart of Pharmacy,Shenzhen Hospital of TCM,Guangzhou University of TCM,Shenzhen,Guangdong Province,518033,China)

Objective To establish a method to simultaneously determine the contents of 6 active ingredients in Yigan Fuzheng Capsules.Methods HPLC-DAD with wavelength switching system was used,as the column,acetonitrile-methanol-0.1%acetic acid solution（gradient elution）as the mobile phase,detection wavelengths at 320nm（0～40min）,and at 254min（40～65min）to detect the active ingredients in Yigan Fuzheng Capsules in 5 manufacturers.Results The spectra of the 6 active ingredients were effectively separated,with good linear correlation with peak areas,and the linear ranges were 0.244～4.88mg·ml-1for gallic acid,0.196～3.92mg·ml-1for polygon in,0.272～5.44mg·ml-1for stilbene glycoside,0.208～4.16mg·ml-1for resveratrol,0.272～5.44mg.ml-1for cinnamyl aldehyde and 0.200～4.00mg·ml-1for tanshinoneⅡA（r≥0.99）.The detection limits were 2.86～8.86ng·ml-1,quantization limits were 10.06～20.86ng·ml-1,consistent with the requirements on ingredient contents.The 6 active ingredients could be detected in products of 5 manufacturers.Conclusion The method is rapid,accurate,with good repeatability,which is suitable for quality control of Yigan Fuzheng Capsules.

Yigan Fuzheng capsules;HPLC;DAD;Active ingredients;Simultaneous determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.01.094

1672-2779（2014）-01-0147-02

��吴义红 本文校对：王曼茹

2013-11-13）

*通讯作者