聂益军（南昌大学第一附属医院检验科细胞室，南昌 330006）

血型是指各种血液成分（包括红细胞、白细胞、血小板等）的遗传多态性，ABO血型为人类红细胞的表面抗原，是一种稳定的遗传标记。正常情况下，血型的遗传标记不会改变，但某些疾病（白血病、恶性肿瘤等）会引起ABO血型抗原或其血清抗体减弱，导致暂时性的“血型变异”，从而难以及时、准确地对ABO血型进行鉴定。由于疾病对ABO血型的影响多局限于免疫血清学，而发生在基因水平上的改变概率较小，因此基因分型是正确鉴定血型不可或缺的辅助手段。现将所涉及抗原及抗体减弱的案例举例说明并加以分析讨论。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者标本来源于南昌大学第一附属医院2011～2012年ABO血型抗原或抗体减弱的临床标本，共计27例，发病年龄15～62岁，血型鉴定前3个月均无输血史。其中男14例，女13例；恶性肿瘤导致的ABO血型抗原或抗体减弱的临床标本10例，白血病导致的ABO血型抗原或抗体减弱的临床标本17例；ABO血型抗原减弱的19例，ABO血型抗体减弱的8例。分别选取A型和B型抗原减弱各1例，O型抗体减弱两例进行探讨分析。

1.2 仪器与试剂 单克隆抗－A，抗－B，ABO试剂红细胞均由上海血液生物制品提供，离心机为日本久保田KA－2200台式离心机；DNA提取试剂Gene One Technology（美国产）；人类ABO血型基因检测试剂盒[序列特异性引物聚合酶链反应（PCR－SSP法）]为天津秀鹏产品；9700扩增仪（美国ABI公司）；凝胶成像仪（美国BIO－RAD）。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型血清学鉴定 ABO血型鉴定为正、反定型，均采用试管法，具体操作见《中国输血技术操作规程》。

1.3.2 ABO血型基因学鉴定（PCR－SSP法）

1.3.2.1 DNA提取 900μL的溶液L1及300μL的全血振荡后离心弃上清液，振荡以打破核细胞团。加入200μL L2 Buffer，振荡后将溶解物放入离心柱子中离心并弃去过滤液。加入400μL溶液W1到离心柱子中，离心并弃去过滤液。加入600μL溶液W2到离心柱子中，离心并弃去过滤液。将离心柱子转移另一干净的离心管中，加入Elution Buffer（60～65℃），浸泡1min后离心30s，移去离心柱子，获得DNA。

1.3.2.2 加样 44μL dNTP－Buffer＋56μL纯水＋0.8 μLTaq酶（5U／μL）＋10μLDNA。

1.3.2.3 扩增 96℃，2min；1个循环→96℃，20s；68℃，60s；5个循环→96℃，20s；65℃，45s；72℃，30s；15个循环→96℃，20s；62℃，45s；72℃，30s；15个循环→72℃，3 min；→4℃保存。

1.3.3 电泳 扩增产物电泳并根据格局表判定结果。

1.3.4 判定标准

1.3.4.1 ABO血型抗原减弱的判定 患者红细胞与单克隆抗－A和（或）抗－B反应凝集强度未达到（＋＋＋）者，包括出现混合凝集时均判定为ABO抗原减弱[1]。

1.3.4.2 ABO血型抗体减弱的判定 用标准A细胞和（或）B红细胞与患者血清反应，凡室温反应低于或等于（＋）凝集者均判定为ABO抗体减弱[1]。

1.3.4.3 ABO血型基因学方法 采用PCR－SSP，扩增产物电泳后在紫外灯下两个条带为阳性，只有一个条带为阴性（内对照）。根据格局反应判定血型。

2 结 果

2.1 试验结果4例血清学试验结果 见表1。

表1 血清学试验结果

图1 基因学电泳图像

2.2 基因学电泳图像 例1和例2的基因学电泳图像见图1。

3 讨 论

ABO血型是人类最重要的一个血型系统，其检测多采用血清学正反定型方法，任何影响抗原或抗体改变的因素均可干扰ABO血型定型的结果。1957年Van Loghem等[2]首先报道了急性粒细胞白血病（AML）患者A抗原减弱，国内也有相关血液疾病导致ABO血型抗原减弱的报道[3－4]。但目前白血病及其他一些血液病导致红细胞ABO血型抗原减弱的原因及确切机制尚未明确，国内外学者普遍认为与下列因素有关：（1）与体内血型基因突变有关联。ABO血型抗原基因位于9号染色体，位于同一染色体的病毒致癌基因c－abl可干扰ABO基因的合成，导致患者红细胞A和（或）B抗原减弱。又由于基因突变也可导致糖基转移酶活性降低，使H抗原转变为A或B抗原的过程阻断，而导致血型抗原减弱。（2）粒细胞白血病患者粒细胞异常增生，使红系细胞增生相对受到抑制，其红细胞的代谢受到干扰，红系增生受抑，造成A、B、H抗原物质减弱。（3）也可能与体内唾液黏蛋白产生过多，遮盖了红细胞表面的抗原部位而导致血型抗原强度变化有关。近年来的研究更多地放在分子生物学的调控机制上，认为在启动子区CpG岛内发现启动子附近有多个特异性半甲基化位点，可能是引起ABO抗原弱表达的原因[5]。有研究表明，造成ABO血型抗原减弱的原因是ABO基因位于人类第9号染色体上，其启动子区域富含CpG岛。ABO基因的表达受到近端启动子甲基化程度的影响，甲基化程度越高，ABO基因的表达就越不活跃，从而导致A、B抗原表达减少[6]。2009年有研究检测了21例患者的ABO位点拷贝数及DNA甲基化变化，其中11例存在1个或2个ABO等位基因表达缺失，另10例患者未检测到ABO mRNA等位基因表达缺失。而在这11例ABO等位基因表达缺失的患者中，有8例（73%）的ABO基因启动子存在甲基化状态[7]。此外，基因突变、染色体易位也可能使血型基因丢失或被掩盖[8]。

本次研究对象中有19例抗原表达减弱，减弱程度从±至＋＋不等（与单克隆抗－A和（或）抗－B反应的凝集程度），这其中有12例为白血病患者，7例为肿瘤患者。白血病患者抗原减弱可能是由于粒细胞的异常增生导致红系增生受抑造成。而肿瘤患者可能与蛋白分泌过多有关。同时本研究发现几乎所有急性白血病造成的ABO抗原减弱，在试管法检测中均表现为混合凝集视野。这是由于疾病在急性发作之前或缓解之后患者红细胞上的抗原相对正常，而急性发作期间红细胞上的ABO抗原急剧减弱所形成的现象[1]。

恶性肿瘤疾病造成抗体减弱可能是由于3方面原因：（1）放化疗时造成的机体正常免疫功能受到破坏；（2）肿瘤细胞的大量生长抑制了正常免疫细胞的活性；（3）大量失血。

本次研究对象中有8例血清抗体减弱，这是由于疾病、化疗等造成机体各大器官衰竭，体内免疫系统抑制，影响了免疫应答过程，使体液免疫、细胞免疫甚至固有免疫水平下降，出现严重感染或机会性感染就会大大增加，感染又会加重免疫抑制，进而使B淋巴细胞活化、增殖、分化的某一个阶段出现异常，抑制浆细胞生成，引起抗体水平下降。但令人关注的是同样为O型患者表现的抗体减弱形式也不尽相同。O型患者抗体减弱可以表现为抗－A和抗－B同时减弱，因为O型个体的抗－AB不是抗－A和抗－B的混合物，抗－AB识别的是A抗原和B抗原上共同的表位。O型患者也可变现为抗－A或抗－B的单独减弱，可能是因为机体免疫系统受到侵害造成免疫球蛋白低下，进而使得免疫球蛋白分泌紊乱而造成抗－A或抗－B的单独减弱。也可能是一种免疫耐受现象，在其胚胎发育早期接触母体的A或B型抗原物质，经胎盘流入体内，反复刺激而发生免疫耐受现象，致使机体对该抗原不能产生免疫反应而相应地不产生抗－A或抗－B[9]。

由于疾病对ABO血型的影响多局限于免疫血清学，而发生在基因水平上的改变概率较小，因此基因分型是正确鉴定血型不可或缺的辅助手段。随着分子生物学技术的发展，检测基因结构的方法不断涌现，尤其是与PCR技术结合的检测技术进一步推动了基因研究的发展。红细胞血型分子生物学有多种，包括PCR－SSP、序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应（PCR－SSOP）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCRRFLP）、PCR－DNA测序、基因芯片等[10]。本次试验研究中，对于ABO血型抗原或抗体减弱的确定就是通过ABO基因分型最终确定的，作者采用PCR－SSP法，其优点在于操作简便、结果直观（图1所示）。序列特异性引物引导的PCR反应（PCRSSP法）的原理是根据不同类型核心序列关键几处碱基的差异设计一系列具有等位基因序列特异性的引物，从对应类型的核心序列起始扩增，直接扩增具有各种序列差异的等位基因特异性片段。PCR产物经电泳分离可以呈现不同的扩增片段图谱从而分析判定标本的基因型。用分子生物学分型技术对红细胞抗原的基因型作鉴定其图像直观而清晰，同时还可以不受血清中自身抗体、不规则抗体、疾病和假、弱凝集的影响，对保证临床安全输血具有重要意义。

总之，ABO血型抗原减弱血清学试验多表现为混合凝集；O型个体抗体减弱可以表现为单一抗体减弱也可表现为抗－A及抗－B抗体同时减弱。对于在疾病发作期而难以正确定型的患者可进行ABO分子生物学试验，从基因型上确定患者ABO血型。必要时，可待患者疾病缓解后复查ABO血型，以便给患者一个真实、明确的ABO血型结果，为今后的临床输血提供支持和保障。

[1]金沙，向东，刘曦，等.疾病导致ABO血型抗原及抗体减弱的分析[J].临床输血与检验，2010，12（1）：61－62.

[2]Van Loghem JJ，Dor fmeier H，Vander Hart M.Two Antigens with abnormal serologic properties[J].Vox Sang，1957，2（1）：16－24.

[3]王湘屏.1例白血病患者血型抗原减弱、抗体缺失[J].中国检验医学与临床，2003，4（2）：74.

[4]黄菲，李翠莹，甘新宇，等.白血病致ABO血型抗原减弱4例[J].中国输血杂志，2011，24（1）：67－68.

[5]应燕玲，陶苏丹，和艳敏，等.一例ABO血型系统B抗原减弱表达的分子机制[J].中华医学遗传学杂志，2011，28（4）：397－400.

[6]Kominato Y，Hata Y，Takizawa H，et al.Expression of human histoblood group ABO genes is dependent upon DNA methylation of the promoter region[J].J Biol Chem，1999，274（52）：37240－37250.

[7]Bianco－Miotto T，Hussey JD，Day KT，et al.DNA Methylation of the ABO promoter underlies loss of ABO allelic expression in a significant proportion of leukemic patients[J].PLoS One，2009，4（3）：e4788－e4791.

[8]Gao S，Worm J，Guldberg P，et al.Genetic and epigenetic alerations of the blood group ABO gene in oral squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer，2004，109（8）：230－237.

[9]董长征，李丽，王秀明，等.O型献血者缺乏抗－B抗体1例[J].临床输血与检验，2003，5（3）：218－219.

[10]胡丽华.临床输血学检验[M].3版.北京：人民卫生出版社，2012：61－62.