金 飞（贵阳护理职业学院，贵阳 550081）

Rh血型和ABO血型是人类最重要的血型，主要分布于人类红细胞表面，天然抗体为IgM类抗体，其中ABO血型关系到临床的输血安全、法医鉴定等方面，其抗原决定簇为糖蛋白。A型个体主要基因为表达糖基转移酶A，其主要功能是将Gal－NAc从UDP－GalNAc分子上转移到H前体糖蛋白上形成A抗原；B型个体表达，将Gal基团从UDP－Gal分子催化转移到H前体糖蛋白上形成B抗原[1]。ABO基因的2个等位基因A101和B101编码糖基转移酶A和B。而在编码区仅有7个核苷酸的差异，分别为297、526、657、703、796、803、930位，导致4个氨基酸残基的不同，即176、235、266、268位。在常见的ABO血型的表型之外，在不同种族和人群之中，发现了很多因糖基转移酶基因A和糖基转移酶基因B低表达所致的ABO变异型。其中B血型的变异型包括5种，分别是B3、Bx、Bm、Bel和Bw。Bw亚型为弱B亚型。关于糖基转移酶基因单核苷酸多态性（SNP）与血型变异的分子遗传机制，国内外也有报道[2－5]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年在本院收集的一个汉族家系的2个姐妹，无近期输血史，ABO血型鉴定时发现，正、反定型不符，随即进行基因诊断，并对先证者进行家系调查；另取101例医院体检健康者，常见的ABO表型进行SNP的筛查。

1.2 常规血型血清学鉴定 进行常规ABO血型的正、反定型鉴定，姐妹和母亲表现为单克隆抗－B侧出现弱凝集，人源性抗－B侧未出现凝集。姐妹血清中抗－B未见，母亲血清中抗－B出现弱凝集。

1.3 标本基因组DNA和总RNA提取 用蛋白酶K法提取家系中共4例的全血的基因组总DNA和用试剂盒法提取全血总RNA。

1.4 聚合酶链反应（PCR）扩增条件 扩增反应总体系为50μL，其中标本DNA 3μL，正向引物2μL，反向引物2μL，超纯水30μL，Taq酶2μL，dNTP 1μL，MgCl25μL，Taq酶Buffer 5μL。95℃预变性5min，95℃30s，62℃45s，72℃45s，28个循环，72℃延伸10min。

1.5 ABO基因扩增和PCR产物纯化 ABO血型基因采用PCR技术进行扩增，采用Primer 5.0设计扩增引物[6]，扩增产物经试剂盒常规纯化，送试剂公司测序。与B101基因比对，确定突变位点为B糖基转移酶基因第721位C＞T的转变，导致糖基转移酶多肽链Arg241Trp的转变。

1.6 ABO基因第721位C＞T变异频率调查 取101例随机无血缘关系标本，以单链构象多态性（SSCP）的方法对ABO基因第6和7外显子进行序列分析，对结果进行比对。

2 结 果

2.1 血清学检查结果 2个先证者的父亲显示正常ABO血型血清学反应，鉴定为B型；而母亲和姐妹反应鉴定为Bw亚型。见表1。

2.2 PCR产物直接序列分析 2个先证者及先证者父亲、母亲的基因组DNA经过PCR测序后发现，父亲的基因序列与GenBank数据库中的序列完全一致，未发现突变。但是2个先证者和母亲B糖基转移酶与GenBank AC000397正常序列经过比对发现第721位C＞T的转变，导致糖基转移酶多肽链Arg241Trp的转变。

2.3 SNP筛查 经过101例SNP筛查，未发现在此位点的突变，说明此位点不是SNP位点。第7外显子不存在第721位C＞T的转变。经过PCR－SSCP检测，发现2个先证者和其父亲均有特异性的条带，说明721位点基因突变，但是在其余101例体检标本和父亲的PCR产物中，未发现此特异性的条带，随机挑取10个标本送测序公司测序，发现结果一致，证实SSCP的可靠性。说明721位点的等位基因频率小于1／101，经过检索基因突变数据库，发现此基因型为Bw03亚型。

表1 家系成员正反定型鉴定

图1

3 讨 论

自从发现ABO血型之后，人类对血型的抗原认识飞速发展。ABO血型存在3个等位基因，分别是A、B和O型。A型由A糖基转移酶基因编码，B型由B糖基转移酶基因编码。酶样蛋白质的长度为354个氨基酸。该蛋白质具有转移酶活性，能将相应的基因连接到前提物质H抗原之上，形成A和B抗原，进而形成4种血型。目前国际上，Olsson等[7]经过筛查发现几十例Bw亚型，其中大部分为B糖基转移酶的变异，大多数为错义突变导致的酶活性的降低和消失，其中十几例瑞典人为721C＞T的突变；2005年Yazer等[8]进一步证实氨基酸变异（Met186val）能够导致的Bw变异型。而在国内，朱发明等[6]发现1例B糖基转移酶基因第721位C＞T的转变，导致B糖基转移酶活性结构域的改变[9]，进而导致其催化功能的减弱或者消失。本研究发现2例Bw亚型，且符合孟德尔遗传定律，是母传女的显性遗传形式。其中母亲为C／T杂合，而2个女儿均为Bw／O杂合。现已发现十几个与Bw亚型有关的B糖基转移酶基因的突变[10－12]，其中大多数位于第7外显子，包括Bw01～Bw11，这些突变导致的氨基酸的变异，主要集中在一段区域之中，而本研究发现的第721位点的突变属于Bw03亚型，这说明Bw03亚型在中国人群中分布较广，在临床输血时一定要注意此亚型，避免因为此亚型的存在，导致血型鉴定的错误，引起严重的输血反应。

值得注意的是，在作者大量收集A亚型或者B亚型的过程中，经过PCR扩增，发现外显子之间的内含子存在多处SNP位点，但内含子SNP位点是否会对糖基转移酶活性产生影响，这种影响是提高糖基转移酶活性，还是降低糖基转移酶活性均未见报道。作者认为，SNP位点的大量存在一定会影响其酶活性，导致A亚型或者B亚型。另外，作者也发现B糖基转移酶的甲基化也很少有人报道，甲基化程度的改变也会影响转录的起始和酶的活性。作者认为，B糖基转移酶的内含子SNP位点和甲基化程度将会是血型研究未来的方向，也将会成为各种亚型诊断的依据。

[1]许先国，洪小珍，刘瑛，等.一种新的B3变异型相关的B糖基转移酶基因M142T突变研究[J].中华医学遗传学杂志，2009，26（3）：254－257.

[2]Yamamoto F，McNeil PD，Yamamoto M，et al.Molecular genetic analysis of the ABO blood group system：1.Weak subgroup：A3and B3alleles[J].Vox Sang，1993，64（2）：116－119.

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[6]朱发明，许先国，洪小珍，等.α1，3半乳糖基转移酶基因721C＞T突变导致Bw亚型[J].中华医学遗传学杂志，2005，22（2）：138－141.

[7]Olsson ML，Irshaid NM，Hosseini－Maaf B，et al.Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies：identification of 15novel A and B subgroup alleles[J].Blood，2001，98（5）：1585－1593.

[8]Yazer MH，Denomme GA，Rose NL，et al.Amino－acid substitutionin the disordered loop of blood group B glycosyltransferase enzyme causes weak B phenotype[J].Transfusion，2005，45（7）：1178－1182.

[9]许先国，洪小珍，刘瑛，等.α1，3半乳糖基转移酶基因新等位基因278C＞T的鉴定[J].中华医学遗传学杂志，2006，23（6）：631－634.

[10]Seltsam A，Hallensleben M，Kollmann A，et al.The nature of diversity and diversification at the ABO locus[J].Blood，2003，102（8）：3035－3042.

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[12]喻琼，吴国光，梁延连，等.一个中国汉族ABO血型亚型家系中发现新的B等位基因[J].中华医学遗传学杂志，2005，22（2）：129－133.