铁皮石斛培养基配方筛选

2014-02-06朱虹娴胡佳丽戚正华马美兰张悦凯

浙江农业科学 2014年11期

关键词：原球茎茎段壮苗

朱虹娴，胡佳丽，戚正华，马美兰，张悦凯

（东阳市农业科学研究所，浙江东阳 322100）

铁皮石斛培养基配方筛选

朱虹娴，胡佳丽，戚正华，马美兰，张悦凯

（东阳市农业科学研究所，浙江东阳 322100）

以铁皮石斛种子、一年生嫩茎为外植体，通过试验筛选种子培养、原球茎增殖、分化成苗、壮苗生根4个阶段的最佳配方。结果显示，铁皮石斛苗在MS培养基中生长状况最好；种子培养最佳配方为MS+0.5 mg· L-1NAA+15%土豆；当添加NAA的浓度为0.2 mg·L-1，6-BA的浓度为2.0 mg·L-1时，铁皮石斛原球茎的增殖率达到最高；适合分化的培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA；铁皮石斛壮苗生根的较佳培养基为MS+0.5 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA+8%香蕉。

铁皮石斛；无菌繁殖；配方筛选

铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科石斛属多年附生草本植物，是名贵中药枫斗的原材料［1］，有“除脾下气，补五脏虚劳羸弱，强阴，久服厚肠胃，轻身延年”［2］之功效。近年来，许多学者对铁皮石斛的有效成分及作用进行了研究，表明其含有多糖、氨基酸及多种元素，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖的作用［3］。随着药材市场对石斛的需求量不断上升，多年的过度开采使得野生资源枯竭，用传统的无性繁殖方式繁殖石斛，其繁殖系数过低，大面积栽培种苗数量无法得到满足，并且成活率低，产量有限，远远满足不了市场的需求［4-5］，本试验旨在通过筛选铁皮石斛种子培养、原球茎增殖、芽分化及壮苗生根的最适培养基，探索并建立一套适宜铁皮石斛生长的组培快繁体系，以促进东阳铁皮石斛产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用浙江农林大学提供的铁皮石斛成熟种子及金华职业技术学院提供的铁皮石斛茎段。

试验用的试剂有75%酒精，次氯酸钠，蔗糖，琼脂，活性炭，苄基腺嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）；还有土豆（pt）、香蕉（bn）、无菌水。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

铁皮石斛成熟种子经自来水冲洗30 min，用75%的酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗3次后备用。

铁皮石斛健壮嫩茎用自来水冲洗30 m in，摘去叶片及膜质叶鞘，用75%的酒精浸泡30 s，并用5%～10%次氯酸钠浸泡8～10 min［6］，再用无菌水冲洗4～5次，切成0.5 cm茎段备用。

培养基中添加20 g·L-1蔗糖，6 g·L-1琼脂，0.5 g·L-1活性炭，调节pH值为5.8。

1.2.2 基本培养基筛选

将准备好的茎段均匀接种在MS，1/2MS，B5，M6等4种培养基中，每个培养基配方10瓶，并做好标记，每瓶接种10个点，培养条件为温度25～28℃，光照强度2 000～2 500 lx，时间14 h·d-1，环境湿度60%～80%。30 d为一个周期，观察其生长情况。

1.2.3 初代培养基筛选

初代培养基配方4种：MS+0.5 mg·L-1NAA+ 15%pt，MS+0.5 mg·L-1NAA，MS+2.0 mg· L-16-BA，MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA。将准备好的成熟种子切开均匀撒在添加不同植物激素的4种培养基上，每个配方10瓶，培养条件为温度20～25℃，光照强度1 500～2 000 lx，时间12 h·d-1，环境湿度60%～80%。培养30 d，观察萌发情况。

1.2.4 原球茎增殖培养基筛选

增殖培养基配方为在MS+0.2 mg·L-1NAA的基础上，分别加0.5，1.0，2.0，3.0 mg·L-16-BA，以不加激素的作对照。种子萌发后培养的原球茎接种于试验培养基中，每个配方重复10次，每瓶接种10个点，培养条件为温度25～28℃，光照强度2 000～2 500 lx，时间12 h·d-1，环境湿度60%～80%。培养30 d，观察增殖情况。

1.2.5 继代（分化）培养基筛选

设置在加0.0或0.2 mg·L-16-BA的MS培养基上，分别加0.0，0.5，1.0 mg·L-1NAA共6个配方。将增殖所得的原球茎接种于分化培养基中，每个配方重复10次，每瓶接种10个点，培养条件为温度25～28℃，光照强度2 000～2 500 lx，时间12 h·d-1，环境湿度60%～80%。培养30 d，观察出苗情况。

1.2.6 壮苗生根培养基筛选

设置在加0.0或0.5 mg·L-1IBA的MS加香蕉80 g·L-1的培养基上，分别加0.0，0.5，1.0 mg· L-1NAA共6个配方。将2～3 cm高的小苗转接到壮苗生根培养基中，每个配方重复10次，每瓶接种10个点，培养条件为温度25～28℃，光照2 500～3 000 lx，时间14 h·d-1，环境湿度60%～80%。培养60 d，观察苗的长势及生根状况。

2 结果与分析

2.1 基本培养基

表1表明，MS，1/2MS和B5基本培养基中培养的茎段均有小芽冒出，但是MS培养基中培养的茎段产生大量白色小芽，并且小芽生长速度较其他培养基快，所以MS为最佳基本培养基。

表1 铁皮石斛茎段在不同基本培养基上的萌发情况

2.2 初代培养基

表2表明，在4个配方的培养基中，添加土豆的配方，种子萌发得较好，且芽较绿于其他3个配方；添加6-BA激素的培养基，种子萌发情况不佳；加入一定浓度的NAA，有利于促进种子萌发，使萌发时间、数量、生长速度均达到较理想的水平。

表2 铁皮石斛种子不同培养基上的萌发情况

2.3 原球茎增殖培养基

表3表明，添加6-BA激素配合一定的NAA有利于原球茎的增殖，当6-BA 2.0 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1的激素配比时铁皮石斛原球茎增殖最佳。

2.4 继代（分化）培养基

表4表明，原球茎分化随NAA浓度的增高而呈现分化不整齐的现象，添加6-BA激素的培养基分化不理想。6个配方以MS+0.5 mg·L-1NAA的较佳。

表3 铁皮石斛原球茎在不同培养基上的增殖情况

2.5 壮苗生根培养基

表5表明，培养基添加香蕉后，铁皮石斛壮苗长根速度较快，添加0.5 mg·L-1NAA和0.5 mg· L-1IBA后，苗长势粗壮，茎段分明，叶片饱满，而无添加植物生长调节剂的则表现叶发黄、茎不正常、根少。表明MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+香蕉80 g·L-1培养基较利于铁皮石斛壮苗生根。

表4 铁皮石斛小苗在不同培养基上的分化情况

表5 铁皮石斛壮苗在不同培养基上生根的情况

3 小结与讨论

经铁皮石斛从种子萌发到壮苗生根的培养试验，得出相应的最佳培养基。基本培养基以MS为宜；种子培养以MS+0.5 mg·L-1NAA+15%pt为最佳，有利于种子转绿及膨大；对于原球茎诱导和增殖，培养基中的激素种类和浓度，以同时添加较高浓度的6-BA（2.0 mg·L-1）和低浓度NAA（0.2 mg·L-1）最好；适合分化的培养基为MS+ 0.5 mg·L-1NAA；壮苗生根以MS+0.5 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA培养基为最佳，茎粗苗高叶长根多，效果最好。当培养基中NAA浓度为0.5 mg·L-1时，铁皮石斛幼苗生根率为100%，且长势良好、生长健壮。李小军等［7］认为添加香蕉泥对石斛试管苗的生根有利，可以促使幼苗生根时间提前，本试验也证明了这一点。

［1］杨一令，来平凡，蒋士鹏.铁皮石斛研究进展［J］.山东中医药大学学报，2008，32（1）：82-85.

［2］魏·吴普等述，清·孙星衍等辑.神农本草经［M］.北京：人民卫生出版社，1982：21.

［3］刘灿兰，尚子义，曲卫玲.铁皮石斛保健产品的研究开发价值［J］.中国民族民间医药，2010：29.

［4］包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛［M］.上海：上海医科大学出版社，复旦大学出版社，2001.

［5］瑞南.珍稀濒危植物石斛［J］.中国林业，2005：15.

［6］李桂锋，铁皮石斛组培快繁工艺及规范化生产体系研究［D］.广州中医药，2008：14

［7］李小军，石泉，维陵，等.香蕉提取物对霍山石斛试管苗壮苗的影响［J］.江苏大学学报：自然科学版，2004，25（6）：469-472.

（责任编辑：张才德）

S 567

0528-9017（2014）11-1699-03

文献著录格式：朱虹娴，胡佳丽，戚正华，等.铁皮石斛培养基配方筛选［J］.浙江农业科学，2014（11）：1699-1671.

2014-08-12