陈吴健，张明哲，林晓佳，吴 蓉，吴志毅，陈 曦，武 扬，吴旭耀

（1.浙江出入境检验检疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境检验检疫局，浙江杭州 310012）

基于ITS序列的菊花花枯病实时荧光PCR检测方法

陈吴健1，张明哲1，林晓佳1，吴 蓉2，吴志毅1，陈 曦1，武 扬1，吴旭耀1

（1.浙江出入境检验检疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境检验检疫局，浙江杭州 310012）

根据菊花花枯病菌与其近似种在ITS序列上的差异，构建特异性引物和探针，并用菊花上常见的病害及其近似种进行验证。结果表明，供试菌株中仅菊花花枯病菌表现出阳性扩增信号，其他菌株和空白对照均未检测到荧光信号。该法可检测到100 fg的阳性DNA，完成整个检测只需约2 h，可快速、灵敏地完成进出境菊花产品中菊花花枯病菌的检测。

菊花花枯病；实时荧光PCR；特异性检测

菊花花枯病（Didymella ligulicola）是菊花上的重要病害，1982年被列入EPPO（欧洲和地中海植物保护组织）检疫性有害生物A2名单中，属于我国的检疫性病害。1904年该病在美国北卡罗那州首先发现并报道；随着菊花切花和盆栽菊花的大量生产，为害日益严重，英、德、荷兰、丹麦、加拿大、肯尼亚、坦桑尼亚、日本、澳大利亚、新西兰等国均有发生，我国目前尚无发生报道［1］。

该病对环境适应能力很强，可在各种恶劣的自然条件下发生，尤其在温室中常年都可发病。因此该病一旦定殖，将会对我国的菊花产业带来毁灭性的打击，即使花费大量的人力和财力，也很难得到根治。鉴于该病危害性严重，适应性强，且我国尚无分布，因此加强检疫是防止该病传入我国的首要手段。但由于切花产品的特殊性，检疫周期的长短直接影响着切花产品的品质，传统的检疫手段耗时长，难度大，且无法从无症状植株上检出该病，因此筛选出适宜、准确、快速的检疫鉴定方法，已成为我国菊花生产及菊花商品进出境亟待解决的问题。

本研究根据菊花花枯病菌与其近似种在ITS序列上的差异，设计了特异性的引物和TaqMan-MGB探针，将实时荧光PCR方法运用于菊花花枯病菌的检测，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

取菊花常见病害及其近似菌株进行试验。标准菌株Didymella ligulicola从CABI购买；番茄亚隔孢菌从ATCC购买，其余供试菌株均为本实验室分离鉴定（表1）。

表1 供试菌株的学名及其寄主

1.2 通用引物和扩增程序

课题组根据标准菌株提取DNA，用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增ITS序列，由大连宝生物技术有限公司合成（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3'）。扩增程序为：96℃热变性3 min；进行35个循环，每个循环94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，最后72℃延伸7 min［2］。

1.3 特异性引物、探针的设计

基于真菌rDNA存在着广泛的保守区域，可用作引物的结合位点，同时存在不同区域进化水平不同的特性，选取菊花花枯病菌rDNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列，运用NCBI数据库信息和DNASTAR软件的序列比较分析功能，结合PCR引物、探针设计的原则，设计具有菊花花枯病菌特异性的实时荧光PCR引物和探针。

1.4 样品制备

取健康菊花叶片表面洗净后，分别接种菊花黑斑病病原细极链格孢（Alternaria tenuissima）和链格孢（A.alternata），灰霉病病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），白锈病病原堀柄锈菌（Puccinia horiana），菊花花枯病菌（D.ligulicola），25℃保湿培养24 h后，取叶片提取DNA［3］。

1.5 菌株和样品DNA提取

供试菌株在PDA上培养后，刮取菌丝，液氮研磨后，取0.1～0.2 g备用；剪取有病斑的菊花叶片组织，液氮充分研磨，取0.1～0.2 g，用PROMEGA试剂盒提取DNA。

1.6 实时荧光PCR扩增

PCR试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。反应体系为20μL，包括10μL 2×Premix Ex Taq、上下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL和探针（5μmol·L-1）0.8μL，2μL模板DNA、0.4μL 50×ROX Reference DyeⅡ，加无菌水6μL补至20μL。

实时荧光PCR检测使用仪器为App lied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System。扩增反应条件为：50℃预热2 min；95℃变性10 min；95℃15 s，60℃1 min，40个循环。

2 结果与分析

2.1 引物和探针

通过Genbank，blast比对，寻找同属近似种的差异位点，设计特异性引物DL1和DL2，探针Probe-DL，由于涉及到专利和知识产权保护，引物和探针序列在本文中不公开。

2.2 方法特异性检测

用表1中的菌株对设计的引物和探针进行特异性检测，结果如图1所示。只有菊花花枯病菌有阳性扩增，荧光信号以指数形式增长，其他菌株均未检测到荧光信号。说明设计的引物和探针对菊花花枯病具有很好的特异性。

图1 方法特异性的检测结果

2.3 方法灵敏度验证

将标准菌株DNA测定浓度后，按梯度稀释为1～6个不同浓度，分别取含有1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg和10 fg的菌丝DNA用于实时荧光PCR检测，结果显示，1～5梯度的菌丝DNA均能检测到扩增的荧光信号，表现为阳性扩增，10 fg的菌丝DNA和阴性对照未检测到扩增信号（图2）。

结果表明该检测方法的检测灵敏度达到100 fg的菌丝DNA。

图2 方法灵敏度的检测结果

2.4 菊花样品的检测

将1.4节中制备的样品DNA进行实时荧光PCR检测，标准菌株作为阳性对照，健康的菊花叶片作为阴性对照。结果表明，阳性对照和接种菊花花枯病菌的样品可见阳性扩增曲线，接种其他菌株的样品和阴性对照无扩增信号。说明该法不仅可用来鉴定菊花花枯病菌菌株，也可用于检测进出境菊花产品中是否携带菊花花枯病菌（图3）。

图3 菊花样品的检测结果

3 小结和讨论

菊花花枯病菌是菊花的毁灭性病害，该病主要侵染菊花花冠，流行快，几天内可使花冠完全腐烂；也可使切花在运销过程中大量落花，给商品菊花造成很大的损失。据报道，1975年该病造成了康涅狄格州温室商品菊花50%以上的损失［4］。为保护菊花产业的健康发展，我国将菊花花枯病菌列入进境检疫性有害生物名录，用检疫手段严防其传入。

目前，传统的形态学检疫方法周期长、难度大，已无法满足当今进出口贸易的实际需求，特别是鲜切花产品，因此分子生物学方法正在被越来越多地应用到进出口植物检疫中。PCR、实时荧光PCR等技术在油菜茎基溃疡病、苜蓿黄萎病菌、油棕猝倒病菌等检疫性真菌病害的鉴定中已得到广泛应用［5-7］，大幅降低了一线检疫人员的工作强度，缩短了检测周期，提高了检出率。

本研究采用标准菌株，通过对其ITS区序列特征的研究，首次建立了菊花花枯病菌的实时荧光PCR特异性检测方法，并通过样品的验证表明，该方法快捷、灵敏度高、特异性强，能够检测到100 fg以上的菊花花枯病DNA样本，整个检测过程为2 h左右，能满足进出境菊花及菊花产品快速通关的要求。

［1］ 朱培良，葛起新.一种危险性病害-菊花疫病［J］.植物检疫，1987，1（4）：298-301.

［2］ 叶云峰，付岗，刘威，等.猫豆炭疽病病原分离与鉴定［J］.植物保护，2013，39（1）：97-98.

［3］ 方中达.植病研究方法［M］.北京：中国农业出版社，1998.

［4］ Pethybridge S J，Hay F S.Influence of Phoma ligulicola on yield and site factors on disease development in Tasmanian pyrethrum crops［J］.Australasian Plant Pathology，2001，30（1）：17–20.

［5］ 周国梁，尚琳琳，林泓，等.油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测［J］.植物病理学报，2011，41（1）：10-17.

［6］ 杜洪忠，吴品珊，严进.苜蓿黄萎病菌实时荧光PCR检测方法［J］.植物检疫，2011，25（2）：45-47.

［7］ 张慧丽，王建峰，段维军，等.油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法［J］.植物保护，2012，38（6）：98-100.

（责任编辑：张瑞麟）

S 432.44

B

0528-9017（2014）11-1695-04

文献著录格式：陈吴健，张明哲，林晓佳，等.基于ITS序列的菊花花枯病实时荧光PCR检测方法［J］.浙江农业科学，2014（11）：1695-1698.

2014-06-24

浙江检疫局重点科技项目（2013ZKZ04）；浙江检疫局科技项目（ZK201110）

陈吴健（1983-），男，农艺师，研究方向为植物病菌真菌、线虫的检疫鉴定。E-mail：cw j@ziq.gov.cn。