■ 赵 燕 朱将伟 黄 嵘 刘 军，3 李 凌

(1.上海市质量监督检验技术研究院，上海200233；2.上海市浦东新区农产品安全检测中心，上海201202；3.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；4.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院，北京100069)

氨基甲酸酯类农药是一类应用广泛的广谱性杀虫剂，在当前的农业生产中发挥了重要作用，但其应用所导致的农药残留给农产品安全和环境生态造成诸多负面影响，相关污染事件屡有报道，因此对其残留量进行监测就尤为重要[1,2]。目前多采用色谱法、色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附分析法等方法对氨基甲酸酯类农药残留进行检测，其中应用最为广泛的方法是HPLC法，但该法在应用时需先将样品衍生，然后再使用荧光检测器分析，操作步骤比较繁琐[3-4]。采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对氨基甲酸酯类农药残留进行分析，可显著简化分析步骤，并且LC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性强、检测结果一般不需再次确证等优点。在本实验中研究了玉米中灭多威等5种氨基甲酸酯类农药残留分析的样品前处理方法和液-质联用分离检测条件。结果表明，本方法操作简便、灵敏度高、净化效果好，可用于分析玉米等粮谷中的氨基甲酸酯类农药残留量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1260/6430高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（3.0×100 mm，1.8-Micron），氨基固相萃取柱（500 mg/6 ml），粉碎机，匀浆机，氮吹仪等。

乙腈（HPLC，德国 Merck），甲醇（HPLC，德国Merck），二氯甲烷（HPLC，美国J.T.Baker），氯化钠（分析纯）。农药标样：灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、克百威、异丙威（购自上海市农药研究所，浓度为1 000 mg/l）。

1.2 色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(3.0×100 mm，1.8-Micron)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)；柱温：40 ℃；进样量：5 μl。

梯度洗脱程序：0 min（20%B）→0.5 min（20%B）→4.0 min（90%B）→9.0 min（90%B）→9.1 min（20%B）→11.0 min（20%B）。流速：0.3 ml/min。

质谱条件及参数：电喷雾离子源，多反应监测扫描，正离子模式，离子源参数（干燥气温度325℃，干燥气流速10 L/min,雾化气压力45 psi，毛细管电压4 000 V）；质谱主要采集参数见表1。

表1 5种农药的LC-MS/MS采集参数

1.3 样品处理

1.3.1 试样制备

取1 000 g待测玉米样品，过筛去除尘土及沙石等杂物，进行粉碎后备用。1.3.2 提取

准确称取20.0 g经粉碎混匀的样品于250 ml三角瓶中，加入约20 ml蒸馏水浸泡15 min，再加入40 ml乙腈，用匀浆机高速匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集于装有7 g氯化钠的100 ml具塞量筒中，剧烈震荡1 min，在25℃下静置30 min，使乙腈和水相分层[5]。

1.3.3 净化

从100 ml具塞量筒中吸取10 ml乙腈溶液（上层）于25 ml刻度离心管中,于70℃水浴上氮气吹至近干，加入2 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）溶解残渣，盖上铝箔，待净化。

将氨基柱用5 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）预淋洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即加入上述待净化的溶液，用试管收集洗脱液，再用2 ml甲醇+二氯甲烷（1+99）洗离心管后过柱，并重复一次。将收集有洗脱液的试管置于50℃水浴上氮气吹至近干，然后用甲醇定容至5 ml。最后用漩涡混合器混匀，过0.2 μm滤膜，装入进样瓶中待测。

1.4 标准曲线与样品测定

将农药标准物质配制成系列浓度的混合标准溶液，进行LC-MS/MS分析，以质谱响应值对应浓度分别制作5种农药的标准曲线。经过处理的样品提取物在上述色谱-质谱条件下进行分析，参照标准曲线用外标法计算样品中各种农药的浓度。

2 结果与讨论

2.1 提取过程及溶剂的优化

由于玉米含水量很低，若直接用乙腈提取玉米中的氨基甲酸酯类农药，回收率很低（低于50%）；在加入乙腈前加水浸泡可显著提高提取效率，但过多的水会影响后续处理过程中水分的去除，从而影响最终的定量分析。通过比较优化，确定加水量为20 ml，并浸泡样品15 min。

在氨基甲酸酯类农药残留分析中常用的提取溶剂有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、石油醚等。本实验分别比较了丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷作为提取溶剂的效果。实验结果表明,当用丙酮或乙酸乙酯作提取溶剂时，溶出的油脂类杂质较多，影响后续净化和上机分析；而用二氯甲烷提取时，由于其比水重而处于下层，不便于操作，且容易发生乳化。而用乙腈作为提取溶剂时，其提取效率高，操作简便，其脂肪类溶出物和溶出杂质均较少，有利于后续的盐析和净化，因此最终选择乙腈作为提取溶剂。

另外，在用氨基柱进行净化的过程中，比较了3种不同洗脱溶液[①甲醇+二氯甲烷(1+99)；②甲苯+乙腈(75+25)；③丙酮+乙醚(20+80)]的效果，结果表明甲醇+二氯甲烷(1+99)作为洗脱溶液时，可有效地除去色素、脂肪等杂质，并显著减少干扰，回收率也更好，综合效果明显优于另外两种洗脱溶液。

2.2 仪器分析条件的优化

流动相的选择：本实验采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，比较了不同体系的流动相[①甲醇-甲酸水溶液(0.1%)；②乙腈-甲酸水溶液(0.1%)；③甲醇-乙酸铵水溶液(2 mmol/l)；④乙腈-乙酸铵水溶液(2 mmol/l)]。结果表明不同的流动相对待测农药的离子化产生较大的影响，乙腈-甲酸水溶液体系对3-羟基克百威影响较大，其峰形差，响应值也不够高；在甲醇-乙酸铵水溶液体系中5种待测农药的响应值均显著低于甲醇-甲酸水溶液体系，而采用乙腈-乙酸铵水溶液体系时，其响应值也不高，另外还影响到涕灭威、克百威和异丙威三种农药的色谱分离度，并且通过优化梯度洗脱程序也未能有效改善。因此，最终选择甲醇-甲酸水溶液作为流动相，同时也对甲酸浓度进行了优化，流动相中的甲酸能有效促进离子化，但浓度高于0.1%时会导致质谱基线噪声显著增加，进而导致灵敏度下降，故选定甲酸水溶液的浓度为0.1%。

为了获得最佳的检测效果，在优化了萃取方式、流动相以及梯度洗脱程序等条件后，对各项质谱参数也进行了优化（表1）。图1为5种氨基甲酸酯类农药标准品混合液的总离子流。

图1 5种氨基甲酸酯类农药混合标准品总离子流

2.3 线性关系与检出限

在上述经优化的测试条件下，取一系列浓度的标准品混合液进行分析，以各农药组分的质谱响应值对其浓度作出曲线，得到各农药的线性回归方程，各农药在1～100 μg/l范围内线性关系良好。当样品中待测的氨基甲酸酯农药被检出，且其浓度超过该线性范围时，需在稀释处理后再次测定。5种氨基甲酸酯农药的线性回归方程、相关系数、检出限和定量下限等见表2，其中检出限以3倍信噪比进行计算得出，以4倍检出限作为定量下限（参考:美国环保署EPA SW-846）。

2.4 回收率测定以及与其它标准方法测定结果的比较

向两组空白玉米样品中加入混合农药标准溶液，使第1组玉米中各农药浓度为5.0 μg/kg，第2组中各农药浓度为20.0 μg/kg。按上述方法流程及选定的参数测定5种农药的含量并计算回收率(n=5)，其回收率范围为81.7%～93.1%，RSD为3.7%～6.9%，均能满足方法学要求。这两组玉米样品同时还按照出入境检验检疫行业标准SN/T 2085-2008进行了测定(n=5)，测定结果见表3，经比较发现，两种方法的测定结果基本相当（SN/T 2085-2008的回收率略高），按SN/T 2085-2008测定时的回收率为84.5%～94.9%。

表2 LC-MS/MS法测定5种农药的回归方程、相关系数及检出限和定量下限

表3 5种农药的回收率和精密度试验结果

3 结语

本文所述方法较SN/T 2085-2008(进出口粮谷中多种氨基甲酸酯类农药残留量检测方法-液相色谱串联质谱法)等标准方法更为简便，极大地简化了样品的前处理过程，缩短了分析时间，各项技术指标也均能达到实际检测工作的要求。运用该检测方法，玉米样品经简便易行的前处理流程处理后，利用LC-MS/MS进行分析，能对玉米中的多种氨基甲酸酯类农药残留进行定性和定量检测，方法快速、简便，拥有满意的灵敏度和准确度，方法的定量限均低于GB2763-2005(食品中农药最大残留限量)所规定的农残限量值，适合玉米等粮谷中氨基甲酸酯类农药残留的测定。